本发明专利技术涉及C12Q包含酶或微生物的测定或检验领域，具体为一种肿瘤抑制剂的激酶酶谱筛选方法；它包括下述部分及步骤：步骤一、激酶浓度的确定及优化；步骤二、激酶ATPKm的测定；步骤三、阳性抑制剂星型孢菌素或其他化合物IC50的测定；本发明专利技术采用上述步骤，其优点在于可一次对66种激酶进行检测，其检测规模大、速度快，并且灵敏度高。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及C12Q包含酶或微生物的测定或检验领域，具体为；它包括下述部分及步骤：步骤一、激酶浓度的确定及优化；步骤二、激酶ATPKm的测定；步骤三、阳性抑制剂星型孢菌素或其他化合物IC50的测定；本专利技术采用上述步骤，其优点在于可一次对66种激酶进行检测，其检测规模大、速度快，并且灵敏度高。【专利说明】
本专利技术涉及C12Q包含酶或微生物的测定或检验领域，具体为。
技术介绍
目前，激酶活性的生化检测方法包括两种:放射性同位素的激酶活性检测方法、非放射性检测方法。其中，基于放射性同位素的方法，有以下缺点:产生大量的放射性垃圾；放射性ATP的半衰期非常短，只有14.3天，因此需要经常订购新的同位素；放射性同位素的方法也不适宜进行高通量或者超高通量筛选；有非常强的交叉干扰现象；对人体有比较大的损害。现在已经开发的一些激酶抑制剂的新药，由于对一些非靶向的激酶有抑制作用而造成了巨大的副作用。因此，对整体的激酶有一个更加充分的认识十分必要，这也就是所谓的激酶酶谱筛选。同时，尽管有多种方法被开发和应用，但由于人类激酶的复杂性和多样性，至今没有任何一种非同位素的方法能够检测所有的激酶活性。因此，必须使用两种或者两种以上的方法对激酶抑制剂进行整体性评价。然而，传统的试验检测方法实验宽度小、速度慢，灵敏度低，且需要耗费大量的人力、物力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供，其具有成本降低，速度增快，灵敏度变高的优点。为了达到上述目的，本专利技术是这样实现的: ，包括下述步骤: 步骤1、激酶浓度的确定及优化； 步骤1.1、确定激酶梯度稀释的最高浓度，将其进行两倍的梯度稀释，得到若干个不同浓度梯度的激酶体系；步骤1.2、将激酶配成一定浓度的溶液，在微孔板中加入缓冲液，并进行两倍的梯度稀释； 步骤1.3、将微孔板里已经稀释好的酶转入检测板，离心，室温放置以达到最高活性； 步骤1.4、配置0%磷酸化多肽以及100%磷酸化作为对照； 步骤1.5、将ATP和多肽的混合溶液转入微孔板中，离心，封膜，振荡，室温反应； 步骤1.6、配置激酶反应转化试剂溶液；加样并离心，封膜，振荡，室温反应； 步骤1.7、在荧光检测器上读数并记录； 步骤1.8、处理并分析实验数据，选取磷酸化率在20%-40%之间的激酶的浓度，生成激酶浓度一磷酸化率曲线； 步骤2、激酶ATP Km的测定； 步骤2.1、根据激酶梯度稀释的结果，确定酶浓度进行ATP Km实验；步骤2.2、配置激酶混合溶液，加入微孔板； 步骤2.3、将ATP进行梯度稀释； 步骤2.4、将微孔板中的ATP转入检测板，离心，振荡，室温孵育； 步骤2.5、配置激酶反应转化试剂，转入检测板，离心，封膜，振荡，室温孵育； 步骤2.6、在荧光检测器上读数并记录； 步骤3、阳性抑制剂星型孢菌素或其他化合物IC50的测定； 步骤3.1、根据激酶梯度稀释和ATP Km实验结果确定IC50实验反应条件； 步骤3.2、确定待测化合物最高浓度，用有机溶剂进行梯度稀释； 步骤3.3、待溶液平衡一定时间后，从微孔板中转移溶液到检测板中，进行离心； 步骤3.4、配置激酶多肽的混合溶液，并转移至检测板，离心，静置一定时间； 步骤3.5、配置ATP溶液，用自动分液器加样，离心，封膜，振荡，室温孵育； 步骤3.6、配置激酶反应转化试剂，加样，离心，封膜，振荡，室温孵育后读数； 步骤3.7、在荧光检测器上读数并记录。所述的肿瘤抑制剂的激酶酶谱筛选方法，荧光检测器的波长选择如下:400nm激发光波长、460nm香豆素发射光波长、535nm突光素发射光波长。本专利技术采用上述步骤，可一次对66种激酶进行检测，其检测规模大、速度快，并且灵敏度高。【具体实施方式】以下通过具体实施例进一步说明本专利技术。，其包括下述步骤: 部分一: 1、确定激酶梯度稀释的最高浓度(可参考Invitrogen公司的相关报道)将其进行两倍的梯度稀释，得到若干个不同浓度梯度的激酶体系。2、将激酶配成终体积为70uL的溶液；在96孔板的第1，3-12列加入35ul的缓冲液，第2列加70ul的激酶溶液，从第2列到第11列进行2倍的梯度稀释，共10个浓度梯度。3、将96孔板里已经稀释好的酶转入384板，每孔5ul，为4复孔(Al、A2、B1、B2，C1、C2、D1、D2,......A11、A12、B11、B12、C11、C12、D11、D12)，1000rpm 离心 20s，室温放置以达到最闻活性。4、配置ATP和0%磷酸化多肽的混合溶液420ul，转入96孔板的11个孔内，并将100%磷酸化的多肽转入第12个孔。5、将上述的ATP/多肽混合溶液转入384板，4复孔；1000rpm离心20s，封膜，振荡2-3min，23°C 反应。6、配置激酶反应转化试剂溶液，先将溶液转入96孔板的12个孔，再转入384板，4复孔，1000rpm离心20s，封膜，振荡2_3min，23°C恒温孵育读数。7、在荧光检测器上读数，滤光镜的选择如下:(见附录I)MirrorBarcode 451 400nm (激发光波长)Barcode 302460nm (香豆素发射光波长)Barcode 207 535nm (突光素发射光波长)Barcode 206 8、处理并分析实验数据,选取磷酸化率在20%-40%之间的激酶的浓度；利用GraphpadPrism生成激酶浓度-磷酸化率曲线。其中，Z-1yte是一种使用蛋白水解酶介导的检测方法，原理是磷酸化后能够保护多肽底物不被蛋白水解酶所切割。其优势在于不需要使用昂贵的分离设备或者抗体就可以进行酶活性的检测。但由于它的信号窗口较小，因此，酶的使用量较其他方法高得多，一般至少需要20%-40%的 转化率才能。下表中所示为Z-1yte反应中推荐的酶的使用量。【权利要求】1.，其特征是:它包括下述步骤: 步骤1、激酶浓度的确定及优化； 步骤1.1、确定激酶梯度稀释的最高浓度，将其进行两倍的梯度稀释，得到若干个不同浓度梯度的激酶体系； 步骤1.2、将激酶配成一定浓度的溶液，在微孔板中加入缓冲液，并进行两倍的梯度稀释； 步骤1.3、将微孔板里已经稀释好的酶转入检测板，离心，室温放置以达到最高活性； 步骤1.4、配置0%磷酸化多肽以及100%磷酸化作为对照； 步骤1.5、将ATP和多肽的混合溶液转入微孔板中，离心，封膜，振荡，室温反应； 步骤1.6、配置激酶反应转化试剂溶液；加样并离心，封膜，振荡，室温反应； 步骤1.7、在荧光检测器上读数并记录； 步骤1.8、处理并分析实验数据，选取磷酸化率在20%-40%之间的激酶的浓度，生成激酶浓度一磷酸化率曲线； 步骤2、激酶ATP Km的测定； 步骤2.1、根据激酶梯度稀释的结果，确定酶浓度进行ATP Km实验； 步骤2.2、配置激酶混合溶液，加入微孔板； 步骤2.3、将ATP进行梯度稀释； 步骤2.4、将微孔板中的ATP转入检测板，离心，振荡，室温孵育； 步骤2.5、配置激酶反应转化试剂，转入检测板，离心，封膜，振荡，室温孵育； 步骤2.6、在荧光检测器上读数并记录； 步骤3、阳性抑制剂星型孢菌素或其他化合物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肿瘤抑制剂的激酶酶谱筛选方法，其特征是：它包括下述步骤：步骤1、激酶浓度的确定及优化；步骤1.1、确定激酶梯度稀释的最高浓度，将其进行两倍的梯度稀释，得到若干个不同浓度梯度的激酶体系；步骤1.2、将激酶配成一定浓度的溶液，在微孔板中加入缓冲液，并进行两倍的梯度稀释；步骤1.3、将微孔板里已经稀释好的酶转入检测板，离心，室温放置以达到最高活性；步骤1.4、配置0%磷酸化多肽以及100%磷酸化作为对照；步骤1.5、将ATP和多肽的混合溶液转入微孔板中，离心，封膜，振荡，室温反应；步骤1.6、配置激酶反应转化试剂溶液；加样并离心，封膜，振荡，室温反应；步骤1.7、在荧光检测器上读数并记录；步骤1.8、处理并分析实验数据，选取磷酸化率在20%?40%之间的激酶的浓度，生成激酶浓度——磷酸化率曲线；步骤2、激酶ATP?Km?的测定；步骤2.1、根据激酶梯度稀释的结果，确定酶浓度进行ATP?Km实验；步骤2.2、配置激酶混合溶液，加入微孔板；步骤2.3、将ATP进行梯度稀释；步骤2.4、将微孔板中的ATP转入检测板，离心，振荡，室温孵育；步骤2.5、配置激酶反应转化试剂，转入检测板，离心，封膜，振荡，室温孵育；步骤2.6、在荧光检测器上读数并记录；?步骤3、阳性抑制剂星型孢菌素或其他化合物IC50?的测定；步骤3.1、根据激酶梯度稀释和?ATP?Km?实验结果，确定IC50实验反应条件；步骤3.2、确定待测化合物最高浓度，用有机溶剂进行梯度稀释；步骤3.3、待溶液平衡一定时间后，从微孔板中转移溶液到检测板中，进行离心；步骤3.4、配置激酶多肽的混合溶液，并转移至检测板，离心，静置一定时间；步骤3.5、配置ATP溶液，用自动分液器加样，离心，封膜，振荡，室温孵育；步骤3.6、?配置激酶反应转化试剂，加样，离心,?封膜，振荡，室温孵育后读数；步骤3.7、在荧光检测器上读数并记录。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：毛伟峰，袁崇刚，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：
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