一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法技术

本发明专利技术公开了一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法。该方法包括九个步骤：(1)制备培养基；(2)制备发酵种子菌液；(3)扩大发酵的条件；(4)抗生素ZwA的第一次纯化萃取法；(5)抗生素ZwA的第二次纯化大孔树脂法；(6)抗生素ZwA的第三次纯化硅胶层析法；(7)高效液相色谱法纯度检测；(8)质谱法分子量定性分析；(9)得到制备出包含分子量为364和382两种分子结构的水溶性抗生素的结论。本发明专利技术所制备的水溶性抗生素纯度高，与苏云金芽胞杆菌的CrylA、Cry1B、Cry1C等晶体蛋白协同作用可以提高对农业害虫的生物杀虫效果；另外对大肠杆菌和引起小儿肺炎的金黄色葡萄球菌也有抑制效果。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法，其特征在于具体步骤为：(1)制备培养基1.1斜面培养基：牛肉膏3?6g，蛋白胨5?15g，氯化钠3?7g，琼脂粉10?20g，pH7.0?7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用；1.2菌株HD?1种子培养基：酵母膏3?7g，蚕蛹蛋白膏5?15?g，氯化钠5?15?g，pH7.0?7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用；1.3初始发酵培养基：葡萄糖10?30g，蚕蛹蛋白膏10?30g，CaCL2?0.05?0.10g，K2HPO4?1?2g，MgSO4?0.1?0.3g，MnSO4?0.05?0.1g，pH?7.0?7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用；1.4扩大生产发酵培养基：蚕蛹蛋白膏7?11g，葡萄糖2?5g，氯化钠?1?4g，MgSO4·7H2O?0.2?0.4g，K2HPO4?0.2?0.4g，MnSO4?0.02?0.07g，pH7.5，定容至1L，121℃灭菌30min备用；1.5供试菌活化培养基：牛肉膏2?8g，蛋白胨5?15g，氯化钠2?8g，pH?7.0?7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用；1.6抑菌活性测定固体培养基：牛肉膏2?8?g，蛋白胨5?15?g，氯化钠5?20?g，琼脂粉10?20g，pH?7.0?7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用；(2)制备发酵种子菌液首先，将保存于?20℃冰箱的甘油保藏菌种HD?1放到室温复苏，至完全解冻，将其接种到LB斜面培养基上，30℃过夜培养，取出后保存于4℃冰箱备用；然后，从保存好的HD?1斜面培养基上取0.5㎝×1.0㎝大小的斜面培养物接种于300mL摇瓶中，内含有种子培养基100mL，置于220r/min摇床30℃培养10?20?h；2.1菌株HD?1发酵液的制备将活化好的HD?1种子培养基以2%的接种量接种到灭过菌的初始发酵培养基中，培养基不超过容器体积的2/3，30℃摇瓶培养20?40?h，然后，5000?10000r/min离心5?15min、收集上清，4℃冰箱保存，此过程有抗生素生物合成；2.2初次抑菌活性检测采用管碟法，以草生欧文氏杆菌为指示菌，检测浓缩10倍后的HD?1发酵液上清液的抑菌活性，空白培养基作对照，将甘油保存的草生欧文氏杆菌菌种接种到活化培养基中，30℃摇瓶培养10?15h，然后2%的接种量将菌液加入到冷却至45℃的抑菌活性测定固体培养基中，轻摇混匀，先在灭菌的玻璃培养皿内加注无菌固体培养基作为底层，冷却后摆放牛津环，再将混匀的加菌液的固体培养基轻轻加入到底层培养基上，双层培养基都要薄而均匀，静置冷却后，用灭过菌的镊子轻轻取下牛津环，在孔中加入待测液，液面和上层培养基面齐平，然后，在28℃恒温培养箱内培养10?15h，测其抑菌圈直径大小，抑菌直径为抑菌圈外径减去牛津环外径，在做抑菌试验时，将上清液95℃水浴15min后，用1mol/L的NaOH调至中性或偏碱性，验证抗生素的存在，由于ZwA的浓度与抑菌圈直径存在线性关系，因此，将以抑菌圈的直径来间接表示ZwA浓度；(3)扩大发酵的条件3.1发酵培养基：采用18L发酵罐培养，罐内装培养基不能超过体积的2/3，以5?15L为宜；3.2发酵时间：将活化好的摇瓶种子培养基接种到扩大生产发酵培养基中，培养20?40h；3.3培养温度：将活化好的摇瓶种子培养基接种到扩大生产发酵培养基中，在20℃?40℃恒温下培养；3.4培养基初始pH：将已接种的扩大生产发酵培养基，用1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH值5.0?10.0；(4)抗生素ZwA的第一次纯化萃取法取10L发酵液分批次5000?10000r/min离心，5?20min，回收上清液，用1mol/L的HCl调至pH4.0，在50℃下真空浓缩，真空度?0.095??0.088Mpa，浓缩至200mL，加入100mL无水乙醇，轻轻摇匀，静置1小时后再次5000?10000r/min离心5?20min，取上清，上清液用等体积的石油醚萃取后，收集水相，至无醇味和石油醚味，加水补至原体积，即得ZwA粗提液，做抑菌试验验证ZwA的存在，之后保存于4℃冰箱备用；(5)抗生素ZwA的第二次纯化大孔树脂法根据ZwA的水溶性强、弱极性等特点，选用非极性大孔树脂LX?68M、LX?22、LX?762及LXA?8对ZwA进行初步纯化；5.1大孔树脂预处理：称取一定量的湿重树脂，使用前均做预处理，流程如下，首先，将称好的树脂装入玻璃层析柱中(60cm×2cm)，用2倍柱床体积的1...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郝再彬，李霞，严丽，张杰，宋福平，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：