本发明专利技术公开了一种大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒及其应用，通过限制性核酸内切酶的作用，将体外PCR扩增出的LuxS基因片段消化并连接到载体pGEX4T-1上，构建出大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒。本发明专利技术表达结果鉴定方法直观明了，具有良好的可操作性和重复性；通过调节诱导物的浓度以及诱导时间，可控制蛋白表达的数量，从而满足不同实验的需求，尤其是密度感应机制相关实验的需求，为不同目的、不同条件的实验提供更相近的对照组别。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒及其应用，通过限制性核酸内切酶的作用，将体外PCR扩增出的LuxS基因片段消化并连接到载体pGEX4T-1上，构建出大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒。本专利技术表达结果鉴定方法直观明了，具有良好的可操作性和重复性；通过调节诱导物的浓度以及诱导时间，可控制蛋白表达的数量，从而满足不同实验的需求，尤其是密度感应机制相关实验的需求，为不同目的、不同条件的实验提供更相近的对照组别。【专利说明】大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒及其应用
本专利技术涉及微生物密度感应机制研究领域，尤其涉及一种大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒及其应用。
技术介绍
密度感应(quorum sensing, QS)是一种微生物细胞间信息传递机制，即细菌通过合成、分泌并感知环境中的信号分子，以调节自身某些基因的表达。信号分子中，自诱导分子-2 (autoinducer-2, A1-2)的产生基因保守存在于微生物中，故而其被认为参与了菌种间的信号传递。由于在自然状态下微生物多以不同菌种混合存在的方式生存，并在菌种间存在广泛的信息交流，所以A1-2这种菌群间的信息调控系统备受重视M。研究其诱导的密度感应机制，有利于理解微生物间生物学行为的调控，并为探索抑制微生物感染提供新的思路。然而对于研究A1-2所介导的密度感应系统的实验来说，只有在体外高效的表达LuxS蛋白，继而考察不同实验组别的差异，才能使得实验结果更可靠更有说服力，现有研究中有通过多肽合成的解决方案，但该方法技术复杂且成本较高，无法广泛用于对比研究。本课题组在研究工作中探讨通过表达质粒的构建获得LuxS蛋白的体外表达，而要在体外获得稳定的IuxS表达则需要一个良好的表达体系。载有强启动子的高拷贝表达载体由于其构建及表达过程便捷、经济，同时又具有稳定以及可调节等特点，提供了快速有效地在体外构建及表达LuxS的可能。目前未见有关于大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒的报导。 Xavier KB,Bassler BL.Regulation of Uptake and Processing of theQuorum-Sensing Autoin`ducer A1-2 in Escherichia coli .J.Bacteriol, 2005,187(1):238 - 248.Kendal I MM, Rasko DA, and Sperandio V.Global Effects of theCell-to-Cell Signaling Molecules Autoinducer-2, Autoinducer-3, and Epinephrinein a IuxS Mutant of Enterohemorrhagic Escherichia coli .1nfect.Tmmun.2007，75(10):4875 - 4884.Surette MG, Miller MB, and Bassler BL.Quorum sensing in Escherichiacoli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harvey1: A new family of genesresponsible forautoinducer production .Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.1999.96(4):1639-1644.Vendevi lie A, Winzer K.Tang CM, et al.Making ’sense’ ofmetabolism: autoinducer-2, LuxS and pathogenic bacteria.Nat Rev Microbiol,2005, 3(5): 383-396。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种可以高效便捷的表达LuxS蛋白的大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒及其应用。为了解决上述问题，本专利技术提供了一种大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒，其特征在于，通过限制性核酸内切酶的作用，将体外PCR扩增出的LuxS基因片段消化并连接到载体PGEX4T-1上，构建出大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒。本专利技术亦提供了大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒在密度感应信号系统研究中的应用。本专利技术的优点在于，本专利技术通过扩增野生型大肠杆菌LuxS基因并利用高拷贝的表达载体构建质粒，继而转入大肠杆菌菌株中，在诱导物异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside, IPTG)的诱导条件下,成功得到了该蛋白的稳定表达。同时表达载体上携带的GST标签也有利于表达蛋白的鉴定,从而可采用商品化的抗GST抗体,利用westernblot等方法鉴定出携带有标签的蛋白表达，表达结果鉴定方法直观明了，具有良好的可操作性和重复性；通过调节诱导物的浓度以及诱导时间，可控制蛋白表达的数量，从而满足不同实验的需求，尤其是密度感应机制相关实验的需求，为不同目的、不同条件的实验提供更相近的对照组别。【专利附图】【附图说明】图1为高拷贝表达载体pGEX4T-l的结构示意图。图2为IuxS基因扩增图，目的基因片段大小为516bp。图3为P-LuxS克隆酶切鉴定图，1-6表示挑取得6个克隆，其中较大的酶切片段约为5000bp,小片段约为360bp。图4为蛋白表达鉴定图，左边附图为考马斯亮蓝的染色图，右边附图为蛋白印迹杂交图，重组的LuxS蛋白大小约为45KD，在为诱导的时间点没有表达或极少的渗漏表达，经诱导后可大量表达。图5为不同浓度IPTG诱导下，菌株MDAI2与M-L之间基因转录水平的差异。【具体实施方式】下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Samtoook等人，分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。菌株，质粒与主要试剂 菌株:大肠杆菌(Escherichia coli)W3110 (上海市口腔医学研究所提供)； IuxS缺陷株MDAI2 (上海市口腔医学研究所提供)；` 感受态大肠杆菌T0P10 (上海市口腔医学研究所提供)； 表达载体PGEX4T-1 (上海市口腔医学研究所提供):载体结构示意图见附图1 ; 培养基:2xYT ； 酶:内切酶:Bgl I1、BamH 1、EcoR I ；连接酶:T4 DNA Ligase ； 诱导物:异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside, IPTG)； 主要试剂盒:细菌基因组抽提试剂盒； 质粒抽提试剂盒； DNA凝胶回收试剂盒； 以上均为北京博大泰克生物基因技术公司产品； 抗体:鼠抗GST单克隆抗体； 带有绿色荧光基团标记二抗。克隆的制备 以大肠杆菌W3110基因组为模板，使用引物L本文档来自技高网...
【技术保护点】
大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒，其特征在于，通过限制性核酸内切酶的作用，将体外PCR扩增出的LuxS基因片段消化并连接到载体pGEX4T?1上，构建出大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄正蔚，王倩，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：
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