带报告基因的BAC-OC43冠状病毒载体系统的构建及应用技术方案

本发明专利技术为带报告基因的BAC-OC43冠状病毒载体系统的构建及应用。所属技术领域为1.分子生物学2.病毒学。更具体涉及一种携带绿色荧光蛋白的BAC-OC43冠状病毒载体系统的构建方法及应用。通过该方法，我们可以快速准确的对OC43基因组进行改造，同时也能方便的对病毒进行半定量分析，为深入研究该病毒的复制机制、致病机理、感染谱以及开发新型疫苗奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
带报告基因的BAC-OC43冠状病毒载体系统的构建及应用
本专利技术属于分子生物学和病毒学领域。更具体涉及一种携带绿色荧光蛋白的BAC-OC43冠状病毒载体系统的构建方法及应用。通过该方法，我们可以快速准确的对OC43基因组进行改造，同时也能方便的对病毒进行半定量分析，为深入研究该病毒的复制机制、致病机理、感染谱以及开发新型疫苗奠定了基础。
技术介绍
冠状病毒属于巢状病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，因电镜下病毒颗粒形似王冠而得名。冠状病毒是病毒界的一个大家族，能感染从哺乳动物到禽类等一大批脊椎动物。根据国际病毒分类学委员会的最新规定，冠状病毒分为α、β、γ和δ4组，分别对应1组、2组和3组冠状病毒和新假定的一个属。α冠状病毒组包括人冠状病毒229E(HCoV-229E)、NL63(HCoV-NL63)以及一些动物冠状病毒如猪传染性胃肠炎病毒(porcinetransmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)和犬冠状病毒(caninecoronavirus，CCoV)等；β冠状病毒包括人冠状病毒0C43、SARS、HKu1以及新近发现的HCoV-EMC等人冠状病毒，还包括鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus，MHV)和牛冠状病毒(bovinecoronavirus，BCoV)等动物冠状病毒；γ冠状病毒组包括禽传染性支气管炎病毒(avianinfectiousbronchitisvirus，IBV)和火鸡冠状病毒(turkeyCoronavirus，TCoV)等。表皮细胞是冠状病毒感染的主要靶细胞，巨噬细胞等分布广泛的细胞也可被感染。冠状病毒的宿主范围相对比较局限，只感染它们的天然宿主以及密切相关的宿主。冠状病毒主要与呼吸道、肠道、中枢神经系统以及肝脏疾病有关，具有胃肠道、呼吸道或神经系统嗜性。冠状病毒感染人体后，还与胃肠炎、上呼吸道和下呼吸道感染有关。1981年，Racaniello和Baltimore将包含脊髓灰质炎病毒全长cDNA的质粒DNA转染宿主细胞，成功构建了首个RNA病毒的全长cDNA克隆；随后，该技术得到了广泛的应用和发展，获得了许多RNA病毒的感染性克隆，包括正链和负链RNA病毒、分节段的和不分节段的RNA病毒。获得cDNA感染性克隆后，可以在DNA水平上通过突变、插入、缺失和互补等手段研究RNA病毒，具有非常广泛的应用前景。冠状病毒庞大的基因组以及携带其复制酶序列的质粒在细菌中的不稳定性长期阻碍了冠状病毒反向遗传学的发展，直到2000年Almazan等首次利用DI-RNA和BAC质粒系统成功构建了TGEV的全长cDNA感染性克隆。此后，通过体外将全场cDNA克隆到BAC载体、体外连接覆盖基因组全长的cDNA以及痘苗病毒载体等相继获得多个冠状病毒的感染性克隆。冠状病毒感染性克隆的构建成功为我们研究冠状病毒蛋白和基因组功能、致病机理、毒力关键位点、病毒载体的开发提供了一个非常好的平台。相对其他病毒载体，冠状病毒载体有独特的优势：(1)冠状病毒为单股正链RNA病毒，复制过程发生在细胞质内，并且不经过DNA中间过程，避免了病毒基因组与宿主细胞DNA的整合。(2)冠状病毒作为目前已知的最大的RNA病毒，有足够的空间来容纳较大的外源基因。(3)冠状病毒主要感染呼吸道和肠道粘膜表面，能刺激肠相关淋巴组织诱导多效的分泌型免疫反应。(4)通过对冠状病毒S蛋白基因的操作可以改变其组织嗜性，从而对载体的组织嗜性进行改造。(5)我们可以获得能够感染多数我们感兴趣的物种的非病原株来开发表达系统；同时还可以获得冠状病毒的感染性cDNA克隆来设计表达系统。(6)我们可以获得能够感染多数我们感兴趣的物种的非致病性的冠状病毒株以及感染性cDNA克隆来设计表达系统。(7)基于冠状病毒独特的非连续转录模式，理论上只要将合适的TRS(转录调节序列)和外源基因一起插入病毒基因组就可以表达。目前，已经开发出了两类基于冠状病毒的表达载体，即辅助病毒依赖的表达载体系统和单基因组表达载体系统。辅助病毒依赖的表达载体系统主要包括两个部分：辅助病毒以及携带外源基因的微型基因组。首先通过对DI-RNA的改造，然后转染感染有辅助病毒的细胞，在辅助病毒的作用下，DI-RNA得以转录、表达。利用该系统，研究者们成功表达了β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)和猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的ORF5(PRRSV主要的保护性抗原)。辅助病毒依赖的表达载体系统在稳定性方面有一定的局限性。比如表达HE蛋白的MHVDI-RNA系统只能稳定传代3次，基于TGEV的表达外源基因的微型基因组也只能稳定传代10次，同时该系统只能应用于能产生DI-RNA的冠状病毒，如TGEV、229E、MHV、IBV等。2006年，加拿大的一个研究团队成功了构建了基于BAC系统的HCoV-OC43全长cDNA感染性克隆，为我们利用HCoV-OC43表达外源基因、研究基因功能打下了基础。在该感染性克隆的基础上，对HCoV-OC43基因组进行改造，构建一种能够表达绿色荧光蛋白的重组HCoV-OC43病毒载体系统，为深入研究该病毒的复制机制、致病机理、感染谱以及开发新型疫苗奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种携带绿色荧光蛋白的BAC-OC43载体系统以及构建方法，具体步骤如下：(1)酶切位点的选择和引物设计所有HCoV-OC43相关的核酸序列均参考ATCC株(Genbank编号AY585228)。根据文献报导，结合对HCoV-OC43基因组ORF的分析，选择了2个外源GFP基因的插入位点：取代NS2和NS12.9基因；然后根据插入位点，在其两端选择了两个特异性的酶切位点用于携带GFP的外源片段的引入，如表1。然后根据选定的外源基因插入位点和酶切位点，设计引物分别扩增GFP以及插入位点与酶切位点之间的基因，用于后续的OverlappingPCR，如表2、表3所示。表1酶切位点的选择及位置表2GFP取代NS2引物列表表3GFP取代NS12.9引物列表(2)带GFP重组片段的构建和克隆包含HCoV-OC43全长cDNA的载体pBAC-OC43FL由PierreJ.Talbot教授惠赠。利用设计的引物，以pBAC-OC43FL、pCSCG为模板进行PCR扩增获得各基因片段。然后采用两步法融合PCR的方法进行三片段融合获得带GFP的重组片段。第一步只加模板不加引物，在低复性温度(50～55℃)下扩增10～13个循环，复性延伸片段之间的重叠部分。第二步取第一步反应的未纯化产物2～3μl，加入到新的PCR体系中。同时加入外侧引物，在高复性温度(62～65℃)下扩增25～30个循环扩增融合片段。此方法可以省去常规的DNA片段两两融合过程中片段的纯化等步骤，同时可以减少非特异性产物的产生，所需时间少且精确度高。利用该方法我们获得了两个个带GFP的重组片段，命名为NS2-GFP(5Kb)、NS12.9-GFP(6Kb)，分别代表GFP取代NS2基因和GFP取代NS12.9基因。融合PCR产物经纯化回收后利用酶切连接的方法克隆到pBluescript载体中。(3)带GFP重组pBAC-OC43的构建根据选定的酶切位点，分别本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型的BAC‑OC43冠状病毒载体系统，将带报告基因的pBAC‑OC43质粒转染宿主细胞后，冻融裂解细胞即可获得能表达报告基因的重组病毒。

【技术特征摘要】
1.一种BAC-OC43重组病毒，其特征在于，所述的BAC-OC43重组病毒的构建方法包括以下步骤：1)将带报告基因的pBAC-OC43质粒转染宿主细胞后，冻融裂解细胞即可获得能表达报告基因的重组病毒；2)HCoV-OC43基因组NS2和NS12.9基因位置作为外源基因插入位点；3)利用HCoV-OC43重组病毒的复制表达外源基因；所述的HCoV-OC43重组病毒的构建及检测方法包括以下步骤：(1)外源基因插入位置的选择以GFP基因取代HCoV-OC43基因组的2个附属基因：NS2和NS12.9，(2)酶切位点的选择和引物设计所有HCoV-OC43相关的核酸序列均参考ATCC株，其Genbank编号AY585228，在选定外源基因插入位点后，在其两端选择了两个特异性的酶切位点用于携带GFP的外源片段的引入，如表1；根据选定的外源基因插入位点和酶切位点，设计引物分别扩增GFP以及插入位点与酶切位点之间的基因，引物序列如表2、表3所示，表1酶切位点的选择及位置表2GFP取代NS2引物列表表3GFP取代NS12.9引物列表(3)融合PCR法构建带GFP重组片段包含HCoV-OC43全长cDNA的载体pBAC-OC43FL，利用设计的引物，以pBAC-OC43FL、pCSCG为模板进行PCR扩增获得各基因片段，然后采用两步法融合PCR的方法进行三片段融合获得带GFP的重组片段，第一步只加模板不加引物，在复性温度为50～55℃下扩增10～13个循环，复性延伸片段之间的重叠部分，第二步取第一步反应的未纯化产物2～3μl，加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭文杰，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11