一种锦紫苏类病毒离体常温保存方法技术

本发明专利技术公开了一种锦紫苏类病毒离体常温保存方法，主要包括以下步骤：样品采集：采摘带有锦紫苏类病毒毒源的鲜活锦紫苏植株叶片或茎干样品；变色硅胶干燥：将离体后12小时内的样品，与等重的变色硅胶密封于塑料保存袋中；室温放置2-3天，观察变色硅胶颜色变化，若硅胶变成浅红色可继续补加硅胶，直至硅胶保持蓝色后无需补加，并将保存袋密封后常温放置。本发明专利技术使用的离体常温保存方法，毒源生物活性的常温保存时间可达1年，保存毒源可用于检测阳性对照、分子克隆以及生物学接种实验等科研工作。成功地解决了锦紫苏类病毒离体后，常温下容易发生降解的问题，极大地方便了锦紫苏类病毒的异地采样、远距离常温运输以及保存工作，节省了人力物力，节约了科研成本。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，主要包括以下步骤：样品采集：采摘带有锦紫苏类病毒毒源的鲜活锦紫苏植株叶片或茎干样品；变色硅胶干燥：将离体后12小时内的样品，与等重的变色硅胶密封于塑料保存袋中；室温放置2-3天，观察变色硅胶颜色变化，若硅胶变成浅红色可继续补加硅胶，直至硅胶保持蓝色后无需补加，并将保存袋密封后常温放置。本专利技术使用的离体常温保存方法，毒源生物活性的常温保存时间可达1年，保存毒源可用于检测阳性对照、分子克隆以及生物学接种实验等科研工作。成功地解决了锦紫苏类病毒离体后，常温下容易发生降解的问题，极大地方便了锦紫苏类病毒的异地采样、远距离常温运输以及保存工作，节省了人力物力，节约了科研成本。【专利说明】
本专利技术属于生物学领域，主要是涉及一种锦紫苏类病毒的离体常温保存方法。
技术介绍
类病毒是一类无外壳蛋白包裹的能在寄主植物中自我复制的环状闭合单链RNA分子，是迄今为止发现的最小病原物(Hataya，1999;李世访等，2000)。其侵染性强，多侵染果树、花草及其它多年生植物，侵染后引起类似病毒感染的矮化、斑驳、叶变形、坏死、裂皮等症状，影响了果实及花色品质，且植株一旦被类病毒侵染将终生带毒，造成了严重的经济损伤。锦紫苏类病毒(Coleus blumei viroid)属于马铃薯纺锤类病毒(Pospiviroidae)科锦紫苏类病毒属，主要侵染锦紫苏(一种在世界广泛种植的观叶性园艺植物)(Fonseca et al, 1989 ;苏前富，2006，植物保护；)。在类病毒研究中，类病毒毒源是一种重要的生物资源，是科学研究和实际应用的基础。毒源的保存工作不仅要维持类病毒的侵染活性，还要使类病毒不产生变异和污染，对后续科研工作至关重要。目前锦紫苏类病毒毒源的保存主要采用活体保存和离体低温保存的方法。活体保存是指通过人工种植带有锦紫苏类病毒毒源的植株进行保存，但由于锦紫苏的耐寒力较弱，冬季越冬温度为15°C，越冬保存需培养温室等条件，耗费人力物力，增加了科研经费。离体保存解决了活体保存费时费力，成本较高的问题，目前锦紫苏类病毒的离体保存主要是将带有毒源的锦紫苏植株叶片置于低温冰箱(-20度或-70度)中冷冻保存，或者通过提取带毒植株叶片中的低分子量RNA，将RNA抽提液放置于低温冰箱中冷冻保存，该方法保存效果较好，但需要低温保藏设备，保存成本较高，且存在冷冻后，常温放置或远距离运输时极易发生降解的问题。
技术实现思路
本专利技术使用的离体常温保存方法，毒源生物活性的常温保存时间可达I年，保存毒源可用于检测阳性对照、分子克隆以及生物学接种实验等科研工作。成功地解决了锦紫苏类病毒离体后，常温下降解的问题，极大地方便了锦紫苏类病毒的异地采样、远距离常温运输以及保存工作，节省了人力物力，节约了科研成本。本专利技术为达到上述目的主要包括以下步骤: (1)样品采集:采摘带有锦紫苏类病毒毒源的鲜活锦紫苏植株叶片或茎干样品； (2)变色硅胶干燥:将离体后12小时内的样品，与等重的变色硅胶密封于塑料保存袋中； (3)室温放置2-3天，观察变色硅胶颜色变化，若硅胶变成浅红色可继续补加硅胶，直至硅胶保持蓝色后无需补加，并将保存袋密封后常温放置。所述的变色硅胶为蓝色变色硅胶，含有微量氯化钴，为玻璃状颗粒，具有硅胶吸附防潮的作用，并可随吸湿量的增加，自身颜色由蓝色变紫色，最后变成浅红色，既起到吸附水分的作用，同时指示环境的湿度，也直观显示是否仍有防潮作用。经过以上方法处理的锦紫苏类病毒毒源可常温存放I年，仍具有类病毒的生物学活性。【专利附图】【附图说明】图1:锦紫苏类病毒(CbVdl)侵染的锦紫苏叶片RNA抽提样Northren杂交检测图 图中:NC，健康锦紫苏叶片RNA抽提样；PC，CbVdl侵染的锦紫苏植株RNA抽提样；1，从CbVdl侵染的锦紫苏植株上采摘的新鲜叶片RNA抽提样；2，用本专利技术方法保存I个月的CbVdl侵染叶片RNA抽提样；3，用本专利技术方法保存3个月的CbVdl侵染叶片RNA抽提样；4，用本专利技术方法保存I年的CbVdl侵染叶片RNA抽提样；5，用本专利技术方法保存I年的CbVdl接种植株的RNA抽提样；6，从CbVdl侵染锦紫苏植株上采摘的叶片，常温放置24小时后的RNA抽提样；7，从CbVdl侵染锦紫苏植株上采摘的叶片，常温放置7天后的RNA抽提样；8，CbVdl环状RNA分子杂交信号；9，CbVdl线状RNA分子杂交信号。【具体实施方式】下面结合附图对本专利技术作进一步描述。1.实验前处理 (1)锦紫苏类病毒侵染的锦紫苏叶片300g，采自温室种植的侵染了锦紫苏类病毒I(CbVdl)的感病锦紫苏植株； (2)将带毒叶片分成两份，一份100g常温放置，另一份200g按本专利技术保存方法处理。2.供试材料 (1)锦紫苏类病毒侵染的锦紫苏叶片，采自感染锦紫苏类病毒I(CbVdl)的感病锦紫苏植株； (2)常温放置24小时后叶片:采自CbVdl侵染锦紫苏植株，常温放置24小时； (3)常温放置7天后的叶片:采自CbVdl侵染锦紫苏植株，常温放置7天； (4)健康锦紫苏叶片:采自健康的锦紫苏植株； (5)用本专利技术方法保存1个月、3个月、1年的CbVdl毒源:通过本专利技术方法处理后的CbVdl侵染植株叶片，分别常温放置1个月、3个月、1年； (6)用本专利技术方法保存1年的CbVdl毒源，接种的锦紫苏植株。3.低分子RNA的提取 (1)称取锦紫苏叶片样品2g，液氮充分研磨后转入离心管，加入2倍体积重量比的1mo l/L K2HP04和0.1% 2-巯基乙醇，再加入2倍体积重量比的水饱和酚/氯仿(1:1 )，充分揽拌，8000 r/min 离心 20 min ； (2)取上层液,加入等体积的水饱和酹/氯仿(1:1)，充分搅拌，8000 r/min离心20min ； (3)取上层液，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20度，放置至少1 h，8000 r/min离心 20 min ； (4)取沉淀，加入5mL的ddH20充分溶解后，再加入5 mL的2.5 mo l/L K2HP04和5 mL的2-甲氧-乙醇,充分搅拌10 min, 8000 r/min离心20 min ； (5)取上层液，加ddH20至62.5mL,加入0.625mL的2%的CTAB，放入冰中至少lh，8000r/min 离心 20min ； (6)取沉淀，加5mL的ddH20充分溶解后，再加12.5 mL的无水乙醇，0.5 mL的pH 5.2，3 mol/L NaAc,摇匀，-20 度，至少 I h, 8000 r/min 离心 20 min ； (7)取沉淀，干燥后，加ddH20100 μ L，洗涤沉淀并转移到1.5 mL EP管中，然后加入等体积的4 mol/L的LiCl,混匀置冰上4 h, 8000 r/min离心20 min ； (8)取上清,加入2.5倍体积的乙醇，-20度，I h, 10000 r/min离心20 min ；(9)取沉淀用70%乙醇500μ L洗两次。干燥后，溶于100 μ L TE，-20度保存备用。4.Northern 杂交检测 (I)DIG-RNA探针标记 酶切 用于标记RN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯婉莹，李世访，姜冬梅，张志想，崔萌萌，王倩，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：