G形夹用于改进的等位基因特异性PCR的用途制造技术

本发明专利技术包括利用等位基因特异性寡核苷酸的等位基因特异性扩增方法，所述等位基因特异性寡核苷酸与靶序列的多于一种变体至少部分互补，但具有与靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸，并且掺入至少一个“G形夹”核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术包括利用等位基因特异性寡核苷酸的等位基因特异性扩增方法，所述等位基因特异性寡核苷酸与靶序列的多于一种变体至少部分互补，但具有与靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸，并且掺入至少一个“G形夹”核苷酸。【专利说明】G形夹用于改进的等位基因特异性PCR的用途专利
本专利技术涉及核酸扩增领域且具体地涉及等位基因特异性扩增领域。专利技术背景 核酸的等位基因特异性扩增允许靶序列的同时扩散和分析。在怀疑靶核酸在其序列中具有一个或多个具有变异(多态性)的亚群时，通常使用等位基因特异性扩增。DNA多态性用于DNA概况分析(法医取证、亲权认定、用于器官移植的组织分型)、遗传作图以及罕见突变的检测，所述罕见突变例如在具有正常DNA的细胞背景中的癌细胞中出现的那些。在成功的等位基因特异性扩增中，靶核酸的所需变体被扩增，而其他变体则未被扩增，至少未扩增到可检测水平。一般的等位基因特异性扩增测定涉及聚合酶链反应(PCR)，其中至少一条引物与具有可疑多态性的区域互补。等位基因特异性引物的设计使得引物延伸仅在存在多态性的某一变体时才发生。以其最简单的形式，等位基因特异性引物具有与靶中的多态性核苷酸的所需变体互补的3’末端核苷酸。通常在引物3’末端处的单个错配足以排除靶序列的不需要变体的扩增。然而，扩增的特异性在不同3’末端序列中变化极大:一些错配有效阻断通过聚合酶的延伸，而其他则不会，参见美国专利号5，639，611。等位基因鉴别的成功取决于DNA聚合酶延伸错配引物的无能性(inability)。DNA聚合酶的这种无能性可以通过调整反应条件来进行调节以达到最大选择性。然而，对于许多多态性序列而言，等位基因特异性PCR低选择性仍是个问题。增加特异性的一种方法涉及改造具有一个或多个内部错配核苷酸的扩增引物。这种方法在一些系统中证明是成功的，参见美国专利5，137，806。增加特异性的另一种方法涉及引物的化学修饰。例如，发现引物中的一些核苷酸的脱氧核糖的某些2’ -C和4’ -C修饰增强通过聚合酶的等位基因鉴别，参见Gaster，J.和Marx, A.(2005) Chem.Eur.J.11:1861-1870。在另一项研究中，发现等位基因鉴别通过在引物的核苷酸之一中使用非天然嘧啶碱基得到增强，特别是在嘧啶环的6位置中具有多个取代基的假异胞苷(pseudoisocytidine),参见美国专利号7，408, 051。在实时等位 基因特异性PCR的背景下，测定的选择性可以测量为匹配和错配模板之间的阈值循环数目(Ct)中的差异。更大的差异指示错配模板扩增中的更大延迟和因此等位基因之间的更大区别。经修饰的脱氧核糖已显示导致在1-14个循环的Ct差异。假异胞苷的使用导致错配模板的扩增中7个循环的延迟。这种鉴别程度对于许多应用(其中样品含有均竞争扩增的模板的几种变体)而言是不足够的。通常错配模板以比匹配模板大得多的量存在。例如，在组织样品中，仅小部分细胞可以是恶性的且携带由等位基因特异性扩增测定靶向的突变(“匹配模板”)。在正常细胞中存在的模板可能以更低的效率被扩增，但极大数目的正常细胞将克服扩增中的任何延迟且消除突变型模板的任何优势。为了在野生型模板的存在下检测罕见突变，等位基因特异性扩增测定的特异性需要得到改进。已提出了增强引物的等位基因特异性的许多方法。然而，对于许多临床上相关的核酸靶，PCR特异性的缺乏仍是问题。因此，设计等位基因特异性引物的新方法是必需的。G形夹(G-clamp)是图1中所示的三环氨基乙氧基-吩噁嗪-2’-脱氧胞苷，其是胞喃唳类似物。当掺入寡核苷酸内时，G形夹同时识别螺旋内的互补鸟嘌呤的Watson-Crick面和Hoogsteen面。因此，当与互补DNA和RNA链杂交时，含G形夹寡核苷酸充分增强螺旋热稳定性和错配区别。这些增强的亲和力和特异性的性质在基于核酸的诊断学和通过反义方法的RNA序列特异性靶向领域中是有利的。G形夹和相关嘧啶衍生物的进一步特征公开于美国专利号6，414，127、美国专利号6，951，931、美国专利号7，511，125和美国专利号RE39, 324 中。专利技术概述 在第一个方面，本专利技术涉及靶序列变体的等位基因特异性扩增的方法，该靶以几种变体序列的形式存在，该方法包括(a)使第一和第二寡核苷酸与靶序列的至少一种变体杂交；其中第一寡核苷酸与靶序列的一种或多种变体至少部分互补，并且第二寡核苷酸与靶序列的一种或多种变体至少部分互补，并且具有与靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中第二寡核苷酸掺入至少一个“G形夹”核苷酸；(b)用核酸聚合酶延伸第二寡核苷酸，其中当第二寡核苷酸与和至少一个选择性核苷酸互补的靶序列变体杂交时，所述聚合酶能够有效延伸第二寡核苷酸，并且当第二寡核苷酸与和至少一个选择性核苷酸不互补的靶序列变体杂交时，则延伸效率明显更低。在第二个方面，本专利技术涉及用于靶序列的等位基因特异性扩增的试剂盒，该靶以几种变体序列的形式存在，该试剂盒包含:Ca)第一寡核苷酸，其与靶序列的一种或多种变体至少部分互补JP(b)第二寡核苷酸，其与靶序列的一种或多种变体至少部分互补，并具有与靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中第二寡核苷酸掺入至少一个“G形夹”核苷酸。 在第三个方面，本专利技术涉及用于进行靶序列的等位基因特异性扩增的寡核苷酸，该靶以几种变体序列的形式存在，该寡核苷酸包含:(a)与所述靶序列的一种或多种变体的部分至少部分互补的序列；(b)与靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸；(C)至少一个“G形夹”核苷酸。在第四个方面，本专利技术涉及用于靶序列的等位基因特异性扩增的反应混合物，该靶以几种变体序列的形式存在，该混合物包含:Ca)第一寡核苷酸，其与靶序列的一种或多种变体至少部分互补JP(b)第二寡核苷酸，其与靶序列的一种或多种变体至少部分互补，但具有与靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸掺入至少一个“G形夹”核苷酸。附图简述 图1显示了脱氧鸟嘌呤和脱氧胞苷之间(A)以及脱氧鸟嘌呤和G形夹之间(B)的氢键相互作用。图2 (A-C)显示了野生型人EGFR基因(SEQ ID NO:1)的编码序列。专利技术详述 定义 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。在描述和请求保护本专利技术中，将使用下述定义。术语“核酸”指核苷酸(例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物等)聚合物，并且包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA-RNA杂交物、寡核苷酸、多核苷酸、适体、肽核酸(PNA)、PNA-DNA缀合物、PNA-RNA缀合物等，其包含以线性(linear)或分支(branched)方式共价连接在一起的核苷酸。核酸一般是单链或双链的，并且一般含有磷酸二酯键，尽管在一些情况下，包括可以具有替代骨架的核酸类似物，包括例如磷酰胺(Beaucage 等人(1993)Tetrahedron 49 (10): 1925);硫代憐酸酯(Mag 等人(1991 )NucleicAcids Res.19:1437 ;和美国专利号 5，644，048)、二硫代磷酸酯(Briu 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：V博德普迪，N舍恩布伦纳，A湛，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：
国别省市：