本说明书的公开内容提供一种可实现高效的探针杂交的靶核酸的检测方法。因此，使用包含与靶核酸预先关联的检测用探针互补的标记序列和识别靶核酸中第1碱基序列的第1识别序列、在所述标记序列和所述第1识别序列之间具有可抑制或停止DNA聚合酶反应的连接部位的第1引物、和包含识别所述靶核酸中的第2碱基序列的第2识别序列的第2引物，扩增靶核酸，使其扩增片段和检测用探针可进行杂交地接触，检测杂交产物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本说明书的公开内容提供一种可实现高效的探针杂交的。因此，使用包含与靶核酸预先关联的检测用探针互补的标记序列和识别靶核酸中第1碱基序列的第1识别序列、在所述标记序列和所述第1识别序列之间具有可抑制或停止DNA聚合酶反应的连接部位的第1引物、和包含识别所述靶核酸中的第2碱基序列的第2识别序列的第2引物，扩增靶核酸，使其扩增片段和检测用探针可进行杂交地接触，检测杂交产物。【专利说明】
本说明书涉及一种检测靶核酸的技术。
技术介绍
—直以来，作为用于生物个体的基因分析或调查生物样本中病毒或细菌等的存在的方法，提出了全面地检测、鉴定、进一步定量核酸序列的方法。在该分析等中，通常，预先制备与靶向的核酸序列关联的探针等，利用该探针等与根据核酸扩增法从生物样本扩增的DNA片段的杂交，用结合在探针或DNA片段上的标记物质检测靶核酸等。例如，记载了在根据核酸扩增法扩增的DNA片段的两端上以包括可以结合特定物质的碱基序列的方式设计引物，利用这种特定物质来检测DNA片段的方法(专利文献I)。另外，开发了专门检测单核苷酸多态性(SNP)的阵列(例如专利文献2、3，非专利文献I)。该方法中，预先制备具有人工碱基序列的检测用探针，设计了可以扩增DNA片段的样本制备步骤，该DNA片段具有结合于该人工碱基序列上的碱基序列。此外，公开了使用阵列目视从细菌中提取出的DNA来检测结核菌的药剂感受性的方法(非专利文献2)。PCR等核酸扩增法通常扩增作为目标的双链部分。因此，核酸扩增产物也呈双链。通过使双链热变性形成单链，使单链的一部分与寡核苷酸等探针杂交，检测是否为目标扩增产物。但是通过热变性使单链和探针杂交，有时会降低杂交效率。·现有技术文献:专利文献专利文献1:国际公开第2009 / 034842专利文献2:特开2006-211982号公报专利文献3:特开2006-101844号公报非专利文献非专利文献I !Analytical Biochemistry364 (2007), 78-85非专利文献2:临床微生物迅速诊断研究会志14:45-50
技术实现思路
所述专利文献I中记载的方法中，扩增DNA片段的特定物质结合部位(可结合特定物质的特定碱基序列)由特定物质识别，并结合于该特定碱基序列上。但是，扩增DNA片段在其特定碱基序列上与其互补链形成双链，不是容易与特定物质发生相互作用的单链状态。因此，特定物质识别特定碱基序列的效率不那么高，需要浓缩结合特定物质后的双链片段。另外，所述专利文献2、3及非专利文献I中记载的方法中，标记步骤中，使单向引物浓度相对提高来进行扩增(也称非对称PCR)等，有目的性地选择性地扩增与阵列上的探针反应一侧的DNA链，从而提高反应性。但是，这种非对称的PCR中，有扩增效率本身降低的倾向。另外，非专利文献2中记载的方法中，可目视检测结核菌DNA，但在从细菌中提取出的DNA适用于阵列之前需要热变性。一般的探针杂交中，作为样本用的DNA扩增片段仍是双链，为有效率地进行与探针的杂交，一般进行热变性或碱变性来形成单链。但是，变性的扩增片段逐渐地恢复成双链，有可能降低杂交效率。另外，抑制该现象时，有时候需要最优化杂交时间或温度等条件。另外，也考虑将得到的DNA双链的核酸5’末端上具有单链(以下，也称标记链)的DNA部分双链作为核酸扩增反应的扩增产物的方法。该方法中作为扩增产物的DNA部分双链可以在两端与其他的DNA链等杂交。因此，可用该DNA部分双链的一条标记链和探针杂交，另一条标记链和标识探针杂交等。该方法中，有可以省略热变性步骤的优点，但本案【专利技术者】认为还存在以下的问题点。即，使用这种DNA部分双链的时，存在标记链的碱基序列的设计上的难度提高的问题。即，DNA部分双链上有2个标记链，并且用该部分双链检测I个靶核酸时，需要一条标记链采用和该靶核酸特异性地杂交的序列，另一条标记链采用不和该靶核酸杂交、不阻碍(不干涉)上述一条标记链和靶核酸的杂交的序列。另外，想要同时检测多个靶核酸时，需要两条标记链不干涉并非该DNA部分双链目标的其他靶核酸。此外，需要以两条标记链互相不杂交的方式设计碱基序列。此外，该方法中，设定扩增条件的难度变高。即，因为不参与扩增的剩余的标记链各自结合到正向、反向的两个引物上。结果为，该方法中，扩增步骤或核酸色谱法的杂交步骤中会有效率下降或由错误杂交(Mishybridization)引起的检测精确度下降的可能。特别是可知，核酸色谱法中，由于有展开溶剂的移动或蒸发的因素，因此与所谓的将阵列浸溃在杂交液中的浸溃型杂交相比也有杂交效率低的问题。鉴于以上的现状，本说明书提供一种可以解决以往的探针杂交中样本DNA片段中的问题、实现高效的探针杂交的、以及该方法中使用的基因扩增剂及杂交用组合物。另外，说明书提供一种更实用的，即，可以用简易的操作并且以高准确度检测靶核酸的靶核酸检测方法以及用于该检测方法的试剂盒等。解决问题的方法本案【专利技术者】从提高适用于探针杂交时与探针杂交的效率、灵敏度的观点出发，就核酸扩增法的修饰进行研究。各种研究结果得到如下见解:在核酸扩增中使用的引物的一部分上导入可以抑制或停止聚合酶反应进行的部位，可提高杂交效率，提高检测灵敏度。另外，得到可以不需要热变性，短时间就可以进行高灵敏度的杂交的见解。本说明基于这些见解提供以下的手段。( I) 一种检测样本中靶核酸的方法，其具有:制备固相体的步骤，该固相体具备具有各自不同的特定的碱基序列的检测用探针；使用第I引物和第2引物实施所述样本中的核酸扩增的扩增步骤，第I引物包含预先与所述靶核酸关联的所述检测用探针互补的标记序列和识别所述靶核酸中第I碱基序列的第I识别序列，在所述标记序列及所述第I识别序列之间，具有可以抑制或停止DNA聚合酶反应的连结部位，第2引物包含识别所述靶核酸中的第2碱基序列的第2识别序列，所述扩增步骤中得到的扩增片段和所述固相体上的所述检测用探针以进行可杂交的接触的杂交步骤，检测所述固相体上的所述扩增片段与所述检测用探针的杂交产物的检测步骤。(2)根据(I)中记载的方法，所述第2引物具有结合了标识物质或其结构可以结合标识物质的标识物质结合区域。(3)根据(I)或(2)中记载的方法，所述第2引物在所述标识物质结合区域和所述第2识别序列之间，具有所述连结部。(4)根据(I)中记载的方法，所述扩增步骤为使用核苷三磷酸实施核酸扩增的步骤，所述核苷三磷酸包括具有标识物质的三磷酸核苷衍生物。(5)根据(I)- (4)中任意一项记载的方法，所述连结部位不包含天然碱基或与天然碱基配对的天然碱基的衍生物。(6)根据(I)- (5)中任意一项记载的方法，所述连结部位包含介由磷酸二酯键邻接所述引物中的核苷酸、且原子个数为2以上40以下的任选被取代的亚烷基链或聚氧化亚烷基链。(7)根据(6)中记载的方法，所述连结部位用以下任意一式表示。5，-0-CmH2m-0-3， 式(I)(式中，5’表示5’端的磷酸二酯键的氧原子，3’表示3’端的磷酸二酯键的磷酸原子，m表示2以上40以下的整数。)，或5，- (0CnH2n) 1-0-3， 式(2)(式中，5’表示5’端的磷酸二酯键的氧原子，3’表示3’端的磷酸二酯键的磷酸原子，η表示2以上4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种方法，其为根据核酸色谱法的靶核酸检测方法，其具备：杂交步骤，使与1个或2个以上靶核酸关联的1个或2个以上的部分双链核酸、和固相载体上与所述1个或2个以上靶核酸关联的1个或2个以上的探针，通过核酸色谱法在可杂交的条件下进行接触；检测步骤，检测所述杂交步骤中产生的杂交产物；对于所述1个或2个以上部分双链核酸，第1条链的5’末端侧上具有作为单链标记部分的可以与所述探针特异性杂交的标记序列，并且至少一部分上具有标识物质或标识物质结合物质。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：丹羽孝介，广田寿一，川濑三雄，
申请(专利权)人：日本碍子株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP
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