双向、可移植的核糖开关介导的基因表达控制装置制造方法及图纸

一种包含核酸分子的可调节的基因表达构建体，所述核酸分子包含操作性连接到靶序列的双向核糖开关。还提供用于有效创建靶-特异性核糖开关的文库筛选策略。茶碱-阻遏型和IPTG-诱导型的核糖开关装置以“双向”方式实现对基因表达控制的可移植控制。靶基因的缺省状态是开启(ON)；所述靶通过加入茶碱而被关闭，并且通过加入IPTG而不改变生长培养基又回到开启状态。所述核糖开关装置以可移植的、可调整的和双向方式调节基因表达，具有多种科学和生物技术的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双向、可移植的核糖开关介导的基因表达控制装置相关专利申请的交叉引用本申请要求2011年6月30日提交的美国临时申请序列号61/503,453的优先权，其通过引用以其整体结合到本文中。1.
本专利技术总体上涉及基因表达的调节。更具体地讲，本专利技术涉及在转录和翻译两者的水平上调节基因表达的RNA调节装置。2.背景通过调节DNA向信使RNA(mRNA)转录的速率或mRNA向相应蛋白质翻译的速率，能够有效调节基因表达。许多基因包含诱导型启动子区，其特异性控制与该启动子区操作性连接的一个或多个基因的表达。这些基因的转录在响应诱导物分子(包括代谢中间体)、物理条件的改变(包括温度变化)和外源分子(例如醇或抗生素)时可以被开启或关闭。然而，诱导型启动子并不适用于所有物理上相关的基因。因此，被称为核糖开关(riboswitch)的基于RNA的基因控制元件已经吸引了越来越多的注意力并且已经开发出人工核糖开关用于各种目的。核糖开关是基于mRNA的调节装置，其介导配体-依赖性的基因表达控制。核糖开关包含适体区，所述适体区结合诱导物分子(配体)，并引起mRNA核糖开关的表达平台部分的结构变化，该变化反过来增加或者降低相应基因的表达。因此，核糖开关在翻译水平上调节基因表达。一个实例是大肠杆菌(Escherichiacoli)中的csrA(碳贮存调节剂)基因的茶碱-应答性ON核糖开关，其提供对所得大肠杆菌开关-csrA突变体生物体的细胞自动聚集和运动力的灵活控制。核糖开关还已经用于通过在诱导物分子例如茶碱存在时介导前-mRNA(pre-mRNA)剪接来调节基因表达。配体-依赖性核糖开关是单向开关，并且，一旦活化，只能通过去除核糖开关配体才可被关闭，这使它们在体内应用中不实用。对于体外应用，生长培养基必须被稀释或改变以去除核糖开关配体。另外，迄今为止所开发的核糖开关对给定靶基因具有特异性，而不适用于其它基因。这种可移植性的缺乏严重限制了适合这些核糖开关的应用。获得在响应2个不同配体时提供双向调节的可移植核糖开关是合乎需要的。可将这样的核糖开关插入到任何靶基因的起始密码子的上游并对该基因的表达进行双向控制。这样的装置将会具有广泛应用，包括对基因功能的科研、包括基因治疗在内的医学应用和生物技术上的应用。3.概述已经发现某些天然的mRNA起到代谢物-敏感性基因开关的作用，其中所述RNA直接结合有机小分子。这样的结合过程改变了mRNA的构象，这通过各种不同机制导致基因表达上的变化。这些天然的“核糖开关”的修饰形式(通过使用各种核酸工程策略而产生)可用作设计者基因开关，其由特定的效应子化合物控制。这样的活化核糖开关的效应子化合物在本文中被称为触发分子。天然的开关是抗生素和其它小分子治疗的靶标。另外，核糖开关的结构允许天然开关的实际片段用于构建新的非免疫原性的遗传控制元件。例如，适体(分子识别)结构域可被调换为其它非天然的适体(或经其它方式修饰的适体)，使得新的识别结构域引起采用用户限定的效应子化合物的遗传调节。这类改变的开关成为治疗方案的一部分-开启、或关闭、或调解蛋白质合成。新构建的遗传调节网络可应用于诸如活的生物传感器、生物体的代谢工程和高级形式的基因治疗等领域。公开了分离的和重组的核糖开关，含有所述核糖开关的重组构建体，与所述核糖开关操作性连接的异源序列，以及携带所述核糖开关、核糖开关重组构建体和与异源序列操作性连接的核糖开关的细胞和转基因生物体。异源序列可以是例如编码目标蛋白或肽(包括报道蛋白或肽)的序列。优选的核糖开关是天然存在的核糖开关或衍生自天然存在的核糖开关。还公开了含有异源的适体结构域和表达平台结构域的嵌合核糖开关。也就是说，嵌合核糖开关是由来自一个来源的适体结构域和来自另一来源的表达平台结构域组成。异源来源可来自例如不同的特异性核糖开关或不同类别的核糖开关。异源适体还可来自非核糖开关适体。异源表达平台结构域也可来自非核糖开关来源。还公开了用于选择和鉴定能够活化、去活化(deactivate)或封闭核糖开关的化合物的组合物和方法。核糖开关的活化是指在结合触发分子后核糖开关的状态上的变化。核糖开关可通过非触发分子的化合物并且以非与触发分子结合的方式活化。术语触发分子在本文中用于指能够活化核糖开关的分子和化合物。这包括核糖开关的天然的或正常的触发分子以及能够活化核糖开关的其它化合物。天然的或正常的触发分子是给定的自然界中的核糖开关的触发分子，或者在某些非天然的核糖开关的情况下，天然的或正常的触发分子是这样的触发分子：针对该触发分子设计核糖开关或者用该触发分子选择核糖开关(正如在例如体外选择或体外进化技术中的那样)。非天然的触发分子可称为非天然的触发分子。核糖开关的去活化是指当触发分子未结合时核糖开关的状态上的变化。核糖开关可通过结合非触发分子的化合物并且以非去除触发分子的方式去活化。核糖开关的封闭是指当触发分子的存在未活化核糖开关时核糖开关的情况或状态。在具体的实施方案中，第一配体与核糖开关的结合活化了阻遏蛋白的表达。反过来，阻遏蛋白表达的活化降低了靶基因的表达。在具体的实施方案中，第二配体与核糖开关的结合降低了阻遏蛋白的表达。反过来，降低的阻遏蛋白表达增加了靶基因的表达。还公开了能够活化、去活化或封闭核糖开关的化合物和包含所述化合物的组合物。还公开了用于活化、去活化或封闭核糖开关的组合物和方法。核糖开关通过结合或去除触发分子而起到控制基因表达的作用。化合物可用于活化、去活化或封闭核糖开关。核糖开关的触发分子(以及其它活化化合物)可用于活化核糖开关。非触发分子的化合物通常可用于去活化或封闭核糖开关。核糖开关还可通过例如从核糖开关的存在中去除触发分子去活化。核糖开关可通过例如结合不活化核糖开关的触发分子的类似物来封闭。在某些实施方案中，控制阻遏蛋白表达的核糖开关的活化降低了靶基因的表达。还公开了用于通过使化合物与RNA分子接触而改变所述RNA分子或编码所述RNA分子的基因的表达的组合物和方法，其中所述RNA分子包含核糖开关。核糖开关通过结合或去除触发分子而起到控制基因表达的作用。因此，使包含核糖开关的目标RNA分子经历活化、去活化或封闭所述核糖开关的条件，这可用于改变所述RNA的表达。表达可由于例如终止转录或封闭核糖体与RNA的结合而改变。根据核糖开关的性质，触发分子的结合可降低或阻止RNA分子的表达或者促进或提高RNA分子的表达。还公开了用于通过将核糖开关与RNA分子操作性连接而调节所述RNA分子或编码所述RNA分子的基因的表达的组合物和方法。可以任何合适方式将核糖开关与RNA分子操作性连接，所述方式包括例如通过将核糖开关与RNA分子物理连接，或通过工程改造编码RNA分子的核酸以包含和编码核糖开关，使得自工程改造的核酸所产生的RNA具有与RNA分子操作性连接的核糖开关。使与目标RNA分子操作性连接的核糖开关经历活化、去活化或封闭所述核糖开关的条件，这可用于改变所述RNA的表达。还公开了用于通过活化、去活化或封闭核糖开关来调节含有所述核糖开关的天然存在的基因或RNA的表达的组合物和方法。如果所述基因是携带该基因的细胞或生物体生存必不可少的，活化、去活化或封闭所述核糖开关可导致所述细胞或生物体死亡、停滞或虚弱。例如本文档来自技高网...

【技术保护点】
基因表达控制装置，包含：氯霉素抗性基因，其以5'至3'方向连接到茶碱‑特异性适体片段；所述茶碱‑特异性适体片段的3'端以5'至3'方向连接到接头部分和5‑nt随机序列的5'端；lacI基因，其前面是其天然核糖体结合位点；和含有4个lac启动子和2个LacIb的天然lacI‑lacZ基因间隔区，其中当将所述控制装置在靶基因的翻译起始位点的上游插入到大肠杆菌MG1655的基因组中时，所述靶基因的转录速率受到与所述适体结合的茶碱的控制。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.30 US 61/5034531.基因表达控制装置，其以5'至3'方向包含：氯霉素抗性基因，其以5'至3'方向连接到茶碱-应答性核糖开关，所述茶碱-应答性核糖开关包含包括ATACCAGCATCGTCTTGATGCCCTTGGCAG的茶碱-特异性适体片段、接头部分和5-nt随机序列，所述5-nt随机序列是以5'至3'方向的TGTAT或CGTAT；其中，所述茶碱-特异性适体片段的3'端连接到接头部分的5'端，并且5-nt随机序列处于5'至3'方向；lacI基因，其前面是其天然核糖体结合位点；和含有4个lac启动子和2个LacIb的天然lacI-lacZ基因间隔区，其中当将所述控制装置在靶基因的翻译起始位点的上游插入到大肠杆菌MG1655的基因组中时，所述靶基因的转录速率受到与所述适体结合的茶碱的控制。2.权利要求1的装置，其中所述靶基因选自lacZ基因座、rpoS基因座和csrB基因座。3.核糖开关盒文库，其包含在5'至3'方向上的氯霉素抗性基因、包括ATACCAGCATCGTCTTGATGCCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：黃建东，金叶，
申请(专利权)人：香港大学，
类型：发明
国别省市：香港;HK