本发明专利技术公开了一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物、探针及其使用方法。所述引物和探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～3所示。本发明专利技术检测牛、羊赤羽病病毒的方法是以样品RNA为模板，利用上述引物和探针，进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增检测，反应结束后，如果出现特异性荧光扩增曲线则判定样品RNA中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阳性。根据模拟标准品制备的标准曲线，可以进行定量一步法实时荧光QRT-PCR扩增检测。本发明专利技术所述检测牛、羊赤羽病病毒的方法安全、快速、特异性好、敏感性强，为畜牧业牛、羊赤羽病的检测以及进境牛羊的检疫工作提供了技术支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒分子生物学检测
更具体地，涉及一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物、探针及其使用方法。
技术介绍
赤羽病（Akabane disease，AKAD）又名阿卡斑病，是由赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）引起的牛、绵羊和山羊的一种多型性病毒传染病。该病的病症主要有流产、早产、死胎、胎儿畸形、木乃伊等，能引起先天性关节弯曲和积水性无脑综合症。该病为虫媒性传染病，传播媒介为吸血的蚊、库蠓等。赤羽病是世界动物卫生组织（OIE）法定通报性疾病，也是我国从国外进口牛、羊必须检测的7种疫病之一。研究表明，该病在我国进口牛、羊的主要国家存在，因此有随着牛、羊进口引进该病的风险。如果该病随着大量牛、羊的进口传入我国，将给我国畜牧业造成严重的经济损失。由于感染动物早期一般不出现临床症状，该病在8～9月份发生流产及早产，且数量激增，至10月份为最高峰，往往被误认为是由热应激引起，不易在感染早期发现。因此，及早发现牛、羊群是否感染赤羽病病毒，是减少生产损失的有效途径。由于感染早期动物体内的病毒复制有限，不易检测，因此感染早期的动物往往检测不出来。为防治和消灭牛、羊赤羽病，首先必须迅速、准确地检测出赤羽病病毒。经过几十年的努力，赤羽病检测技术从最早的病毒分离鉴定到血清学试验，目前已发展为更敏感、更特异、更方便、更经济的分子生物学检测技术。张吉红等根据GenBank中赤羽病病毒的基因序列，设计了特异性引物和探针，建立了检测赤羽病病毒的Real-time RT-PCR方法，但是其敏感性并不是特别好，检测下限为1.18ng/μL，仍然满足不了对感染早期牛、羊群准确检测的要求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有检测牛、羊赤羽病病毒方法的敏感性不足等问题，提供一组准确、快速、特异性好、敏感性更强的检测牛、羊赤羽病病毒的引物、探针及其使用方法。本专利技术的目的是提供一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物和探针。本专利技术另一目的是提供一种利用所述引物和探针检测牛、羊赤羽病病毒的方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供了一组检测牛、羊赤羽病病毒核酸的引物，所述引物为Pf99/AKAV和Pr184/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。本专利技术还提供了一种检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，所述探针为Pb132/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。优选地，所述的报告荧光染料为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3或CY5中的一种，所述的淬灭荧光染料为BHQ1、BHQ2、TAMRA、ROX或DABCY1中的一种。更优选地，所述的报告荧光染料为FAM，所述的淬灭荧光染料为BHQ1。本专利技术所述引物和探针是根据Genebank上公布的赤羽病S基因保守片段序列，利用Primer Express 3.0基因分析软件设计。所有引物和探针的合成均由上海英骏生物技术有限公司完成。本专利技术还提供了一种利用上述引物和探针检测牛、羊赤羽病病毒核酸的方法，该方法是以样品的核酸为模板，利用引物Pf99/AKAV和Pr184/AKAV，以及探针Pb132/AKAV进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增；所述扩增的结果判定方法为：反应结束后，如果出现特异性荧光扩增曲线则判定样品的核酸中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阳性。优选地，所述样品的核酸为RNA。优选地，所述实时荧光QRT-PCR扩增的反应体系如下：2×quant one step probe QRT-pcr master mix 25μL；hotmaster taq polymerase（2.5U/μL） 2.0μL；quant rtase（for one step） 0.7μL；引物Pf99/AKAV 0.2μL；引物Pr184/AKAV 0.2μL；探针Pb132/AKAV 0.1μL；模板 20.0μL；ddH2O 1.8μL。优选地，所述实时荧光QRT-PCR扩增的反应条件如下：50℃逆转录30min；92℃变性3min；以92℃、10s，55℃、30s，68℃、60s预扩增4个循环；92℃、10s，60℃、40s（收集荧光信号）主扩增40个循环。本专利技术所述引物具有特别好的灵敏度，对牛、羊赤羽病病毒的检测下限为1.58×10-4 ng/μL，很好地解决了敏感性问题，同时具有非常好的特异性。同时，本专利技术提供的引物、探针用于检测牛、羊赤羽病病毒的检测，其扩增模板不仅仅可以是牛、羊赤羽病病毒的RNA，还可以是牛、羊赤羽病病毒的cDNA或病毒质粒，检测范围更广，应用性更强。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一组检测牛、羊赤羽病病毒的实时荧光QRT-PCR引物和探针，以及利用所述引物和探针检测牛、羊赤羽病病毒的方法。所述引物具有特别好的灵敏性，对牛、羊赤羽病病毒的检测下限为1.58×10-4ng/μL，远远低于现有检测技术的检测限，并且特异性和重复性也非常好。本专利技术所述检测牛、羊赤羽病病毒的方法，可直接检测病毒RNA，无需分步骤反转录，加样方便快速，减少污染的机会；无需电泳检测，判定结果依据仪器软件曲线和数值，比观察电泳条带更客观，误差更小；不使用溴化乙锭，保障了工作人员的安全；并且检测时间比普通的RT-PCR提前了2～3h，为畜牧业牛、羊赤羽病的检测，尤其是进境牛、羊的赤羽病检疫工作提供了技术支持，具有非常好的推广应用价值。同时，本专利技术提供的引物、探针用于检测牛、羊赤羽病病毒的检测，其扩增模板不仅仅可以是牛、羊赤羽病病毒的RNA，还可以是牛、羊赤羽病病毒的cDNA或病毒质粒，检测范围更广，应用性更强。附图说明图1 为RNA模拟标准模板的实时荧光QRT-PCR检测标准曲线。图2为cDNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一组检测牛、羊赤羽病病毒核酸的引物，其特征在于，所述引物为Pf99/AKAV和Pr184/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
2.一种检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，其特征在于，所述探针为Pb132/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。
3.根据权利要求2所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，其特征在于，所述的报告荧光染料为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3或CY5中的一种，所述的淬灭荧光染料为BHQ1、BHQ2、TAMRA、ROX或DABCY1中的一种。
4.根据权利要求2所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，其特征在于，所述的报告荧光染料为FAM，所述的淬灭荧光染料为BHQ1。
5.一种检测牛、羊赤羽病病毒核苷酸的方法，其特征在于，该方法是以样品的核酸为模板，利用引物Pf99/AKAV和Pr184/AKAV、探针Pb132/AKAV进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增；
所述扩增的结果判定方法为：扩增反应结束后，如果出现特异性荧光扩增曲线，则判定样品的核酸中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阳性。
6.根据权利要求5所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的方法，其特征在于，所述样品的核酸为RNA。
7.根据权利要求5所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的方法，其特征在于，所述一步法实时荧光QRT-PCR扩增的反应体系如下：
2×quant one step probe QRT-pcr master mix ...
【专利技术属性】
技术研发人员：鱼海琼，林志雄，陈茹，翟建新，罗长保，赵吟，贾坤，田纯见，朱道中，王宏，
申请(专利权)人：广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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