辅助筛选和培育抗条锈病小麦新品系的专用引物、试剂和试剂盒及其选育方法技术

本发明专利技术提供辅助筛选和选育抗条锈病小麦新品系的引物对。引物对为Xcfd141和/或Xgwm71；其中，Xcfd141-F：CGTAAAGATCCGAGAGGGTG；Xcfd141-R：TCCGAGGTGCTACCTACCAG；Xgwm71-F：CAAGTGGAGCATTAGGTACACG；Xgwm71-R：GGCAGAGCAGCGAGACTC。本发明专利技术还提供辅助筛选和选育抗条锈病小麦新品系的试剂、试剂盒及筛选和选育抗条锈病小麦新品系的方法。本发明专利技术的方法辅助选择既能提高育种效率，又能保证抗病性的有效选择。选育一个新品种，传统育种一般需要8-10年时间，应用本发明专利技术的分子标记辅助选择理论上仅需3-5年时间，大大地缩短了育种进程，提高了育种效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及辅助筛选和培育抗条锈病小麦新品系的专用引物、试剂和试剂盒及其选育方法。
技术介绍
小麦条锈病是由小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）引起的一种叶部气传病害，分布广、危害严重。我国是世界上最大的小麦条锈病流行区，其中，西北和西南地区尤为严重，此区域也是小麦条锈菌新小种的策源地。甘肃陇南、天水、陇东等地区是我国小麦条锈菌最重要的越夏区和东部小麦主产区秋苗发病的主要菌源基地。越夏区菌源量的多少与东部小麦主产区秋苗发病与否和发病程度关系密切。从20世纪50年代至今，我国曾发生过8次较大规模小麦条锈病流行，其中1950、1964、1990和2002年四次大流行发生面积最大，危害也最重，前两次发病面积达2亿亩以上，后两次发病1.1亿亩以上，分别损失小麦600、300、265和100万吨（万安民等，2002年我国小麦条锈病发生回顾 植物保护 2003，29：5-8）。近五年来条锈病发生程度年度间有差异。2009年小麦条锈病发生范围涉及16个省（市、区），发生面积已近6000万亩，其发生范围和程度是近20年来罕见的（中国农科院植保所 陈万权，http://finance.people.cm.cn/nc/GB/61158/9399555.html）。2010-2011年国内因春季旱情严重，条锈病发生轻，对小麦产量影响小。2012年小麦条锈病中度发生，局部地区发生较为严重，该年度是筛选抗条锈病品种的绝佳时期，小麦生产发病面积涉及陕、甘、青、川、云、贵、湖北、重庆等地，发生范围广，危害程度大。近年来因气候变化、药剂拌种和秋苗期、春季及时查病等原因，条锈病得到了较大控制。但因条锈菌越夏率、越冬率的提高、品种抗病性下降、新生理小种的出现等，小麦条锈病流行的势头时有发生。选育抗病品种是防治小麦条锈病最经济、安全、有效的方法。目前已经命名的小麦抗条锈病基因有56个，分布于53个位点（有3个复等位基因），其中大多是小种专化性苗期抗病基因。苗期抗病基因因好选择、抗性明显而深受育种家喜爱，但生产上大面积种植单一小种专化抗病基因品种，会加速病原菌小种的定向化选择，并哺育优势小种种群的增长，加快抗锈品种抗病性丧失频度。如“洛类”和“繁6”衍生系的大面积种植产生了新致病小种CYR31和CYR32，从而导致了2002年的条锈病大流行。因认识到单一抗病基因的潜在危害，育种学家和植病学家希望通过利用多基因聚合、基因布局和多系品种来延长苗期抗病基因的使用期。长期的研究和实践证明，要实现多基因聚合、基因布局和多系品种，必须有丰富的有效抗源，目前已知的有效抗病基因仅有Yr5、Yr15、Yr18、Yr26和Yr29等，要仅仅依靠这些基因实现小麦条锈病持续控制，难度很大。因此寻找和发掘新的抗源极重要。当然利用分子标记辅助选择，加速优异抗源的有效利用也异常重要。目前，国内外已克隆了许多植物抗病基因（R），这些R基因尽管针对不同的细菌、真菌、病毒、线虫等，但它们编码的蛋白产物却具有惊人的结构相似性。普通小麦（Triticum aestivum L.）是异源六倍体，不仅包含A、B和D三个同源染色体组，而且基因组非常庞大，重复序列高达80%以上，加之小麦条锈菌为活体寄生，致使目前已克隆的小麦条锈病抗病基因仅三个，即Yr10、Yr18/Pm38/Lr34、Yr36。Yr10基因全长3630 bp，包含2个外显子（Exon）和1个内含子（Intron），Yr10为小种转化基因，其结构具有典型的NBS-LRR，与已克隆的抗病基因在氨基酸水平上表现出一定程度的相似性。Lr34基因是一个同时兼抗小麦条锈病（Yr18）（Suenaga et al.，2003）、白粉病（Pm38）（Lillemo et al.，2008）和秆锈病（Sr57）（Singh et al. unpublished）的“一因多效”基因，同时还与大麦黄矮病毒病抗性（Bdv1）（Singh，1993）有关，为ABC转运子基因。Yr36在成株期较高温度（25-35℃）下表现广谱抗性，在低温下则表现感病（15℃以下），包含一个与类固醇生成急性调节蛋白相关的脂类转运结构域Start区域（Uauy et al.，2005；Fu et al.，2009）。Yr18/Lr34/Pm38和Yr36与已克隆的抗病基因不论在蛋白质水平还是DNA水平，都没有显著的相似性，而且两个基因之间没有共同的结构域；说明成株抗病基因的分子机制更复杂。目前位于1BL染色体的Yr29/Lr46/Pm39和4DL染色体的Yr46/Lr67/ Pm46以及5AL染色体上的Yr48等成株抗性基因的共分离或者紧密连锁的分子标记已经发掘（Rosewarne et al.，2008；Herrera-Foessel et al.，2011；Lowe et al.，2011），这些基因的克隆工作正在进行中。随着越来越多抗条锈病基因的克隆和功能分析，将有助于人们深入理解植物抗病的分子机制，为培育持久、兼抗型小麦品种提供理论依据。分子标记辅助选择是借助与目标性状紧密连锁或者共分离的分子标记对后代株系进行目标基因或者染色体区段的筛选，不仅在早代可获得含有目标基因的优良单株，减少常规抗病鉴定工作量，避免接种不均匀、发病不充分或者鉴定不准确带来的错误选择，而且可聚合多个抗病基因，极大地提高持久抗病育种效率。分子标记辅助选择技术已在澳大利亚、美国和国际玉米中心（CIMMYT）等小麦改良研究中大量应用，并将抗虫、抗病和品质基因聚合于一起，选育出了兼抗病虫、优质、丰产节水的小麦新品种，在成果释放区域发挥了巨大的作用。我国在这方面虽然也有一定的研究，但应用成效的报道较少。陇鉴127是一个在甘肃多年推广面积超过百万亩的冬小麦品种，2002年获甘肃省科技进步一等奖，是一个集高产、抗旱、抗条锈于一体的优异品种。经十多年在甘肃陇南、陇东麦区的广泛种植，对当前流行小种条中29、31、32、33等一直表现出稳定抗性。因陇鉴127的抗条锈性，2002年在条锈病流行期间，为当地的农业生产做出了巨大贡献。在2007-2008年，用条中29、31、32、水4、水5、水7、水14、HY8等20个中国条锈菌生理小种对陇鉴127进行了基因推导，结果显示陇鉴127对其中13个菌种表现为中到高抗，其抗谱不同于任何一个已知基因，表明可能含有新的抗条锈基因。经过对陇鉴127抗病基因的标记定位，发现其携带一个新的小种专化抗病基因，并以SSR和Dart标记将其定位于3D染色体，进一步证明了以上结论的正确性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供辅助筛选和选育抗条锈病小麦新品系的专用引物、专用试剂和试剂盒及其选育方法。本专利技术用于辅助筛选和选育抗条锈病小麦新品系的SSR分子标记（即引物对）有2个：Xcfd141、Xgwm71，其序列详见引物表（表1）。本专利技术提供的用于辅助筛选和选育抗条锈病小麦新品系的SSR分子标记为以下三种中任意一种：1）  所示引物为引物对1：Xcfd141，涉及引物对1的核苷酸序列1和序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种辅助筛选和选育抗条锈病小麦新品系的引物对，所述引物对为Xcfd141和/或Xgwm71；
其中，Xcfd141-F：CGTAAAGATCCGAGAGGGTG；
Xcfd141-R：TCCGAGGTGCTACCTACCAG；
Xgwm71-F：CAAGTGGAGCATTAGGTACACG；
Xgwm71-R：GGCAGAGCAGCGAGACTC。
2.一种用于辅助筛选和选育抗条锈病小麦新品系的试剂，包括试剂1和/或试剂2；
所述试剂1为包括引物对Xcfd141的PCR试剂1；
所述试剂2为包括引物对Xgwm71的PCR试剂2。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述PCR试剂1由所述引物对Xcfd141、dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液组成；所述PCR试剂2由所述引物对Xgwm71、dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液组成；
所述PCR试剂1、PCR试剂2中dNTP中的每一种在其所在的PCR试剂中的终浓度均为0.2mM；所述DNA聚合酶在以上PCR试剂中的终浓度为0.067U/μl。
4.一种用于辅助筛选和选育抗条锈病小麦新品系的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求2或3中所述的PCR试剂1和/或PCR试剂2。
5.一种辅助筛选抗条锈病小麦新品系的方法，是用权利要求1所述引物对、权利要求2和3所述试剂或权利要求4所述试剂盒对待测小麦进行PCR扩增，电泳检测PCR扩增产物中目标抗性基因存在与否：分别以不携带分子标记连锁基因和携带分子标记连锁基因的材料为阴阳性对照，如果待测小麦与携带分子标记连锁基因材料带型一致确定为或候选为抗条锈病小麦，如果待测小麦和不携带分子标记材料带型一致确定为或候选为非抗条锈病小麦。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；随后45个循环：94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min；最后延伸8min。
7.一种辅助选育高产和／或抗条锈病小麦的方法，其特征在于：步骤如下：
1）以...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨芳萍，杨文雄，白斌，袁俊秀，虎梦霞，
申请(专利权)人：甘肃省农业科学院小麦研究所，
类型：发明
国别省市：