间充质干细胞体外传代基因组稳定性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测间充质干细胞体外传代基因组稳定性的方法，由下述步骤组成：（1）原代分离间充质干细胞；（2）对原代分离的间充质干细胞进行短期传代，冻存建库。定义为供者原代传代细胞库；（3）复苏供者原代传代细胞，并对其进行长期传代；（4）提取低代次和高代次脐带间充质干细胞之基因组DNA；（5）采用高通量的生物芯片或测序技术，比较低代次和高代次间充质干细胞基因组DNA的差异；（6）基于高通量分析结果，对供者原代传代细胞基因组稳定性做出评价。本发明专利技术可以排除基因组不稳定的间充质干细胞，筛选出基因组稳定的间充质干细胞，增加干细胞临床应用的安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测间充质干细胞体外传代基因组稳定性的方法。
技术介绍
在积累了一定的对干细胞的生物学特征的基础研究之后，干细胞已经逐渐地走向临床应用研究，成为转化医学的重要方面。除直接进行移植的造血干细胞移植之外，众多基于细胞的治疗方法都需要对干细胞进行体外培养及扩增。虽然间充质干细胞来源广泛，但其体内含量较低。为了满足临床使用的需要，间充质干细胞需要进行体外传代培养，有时还需要较大规模的体外培养。体外扩增培养对间充质干细胞的生物学特性是否会发生影响，是否会改变间充质干细胞的基因表达情况，是否会影响干细胞遗传物质的稳定性，是否会改变其表观遗传学特征，是否会带来不安全的隐患？这一系列问题都困扰着体外培养扩增的间充质干细胞应用于临床研究，也是要回答干细胞治疗安全性所必须面对的问题。在众多安全性问题之中，基因组稳定性是最关键的、也是最被人们重视的问题。然而，目前还没有评价间充质干细胞体外传代过程中基因组的稳定性的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供一种有效地评价间充质干细胞体外传代过程中基因组稳定性的方法。本专利技术的技术方案概述如下：一种检测间充质干细胞体外传代过程中基因组稳定性的方法，由下述步骤组成：（1）原代分离间充质干细胞；（2）对原代分离的间充质干细胞进行短期传代，并冻存建库；（3）对间充质干细胞进行长期传代（4）提取低代次和高代次的间充质干细胞之基因组DNA；（5）采用高通量的生物芯片或测序技术，比较高代次和低代次间充质干细胞基因组DNA的差异；（6）基于高通量分析结果，对低代次的间充质干细胞基因组体外传代稳定性做出评价。其中，本专利技术所述的原代分离的间充质干细胞是指从各种组织中分离间充质干细胞，例如骨髓、脂肪、脐带、脐血、胎盘等组织。这些原代分离的细胞可以被定义为P0代细胞。本专利技术对原代间充质干细胞进行短期传代后，细胞冻存入库。该细胞库为低代次间充质干细胞库。需要对低代次间充质干细胞库进行包括微生物、增殖能力、细胞表面分子标记、成骨、成脂、成软骨分化能力的检测，确认其满足间充质干细胞的基本要求，且无微生物污染。本专利技术中冻存低代次间充质干细胞时所使用的细胞冻存保护液可以含有或不含有动物血清和/或DMSO。本专利技术所述的基于高通量分析结果，对低代次的间充质干细胞基因组体外传代稳定性做出评价是指基于高通量分析结果，排除基因组不稳定的间充质干细胞，筛选出基因组稳定的间充质干细胞，增加干细胞临床应用的安全性。本专利技术中对间充质干细胞进行长期传代所使用的培养基可以为含有血清的培养基，也可以是无血清培养基。由上可以看出，本专利技术可以为检测间充质干细胞体外传代基因组提供一种稳定的方法，通过选择合适的供者来源细胞，为提供基因组稳定的细胞治疗产品提供了条件。附图说明图1为对低代次脐带间充质干细胞库进行微生物、增殖能力、细胞表面分子标记图；图2为9个脐带间充质干细胞样本CNVs变化图；图3为图3为9个不同供者来源的hUC-MSCs长期传代过程中发生的CNVs在染色体上的展示图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1检测脐带间充质干细胞体外传代过程中基因组稳定性（1）从脐带组织中分离脐带间充质干细胞；（2）待细胞达到90%融合后，按1:3的比例对原代分离的脐带间充质干细胞进行传代；（3）在传代到第3代（P3）时对脐带间充质干细胞进行冻存，建立低代次脐带间充质干细胞库，冻存过程中采用含有血清且含有DMSO的冻存保护液；（4）对低代次的脐带间充质干细胞进行传代培养至P30。传代培养过程中采用含有动物血清的培养基。传代比例为1:3。（5）对低代次脐带间充质干细胞库进行微生物、增殖能力、细胞表面分子标记（图1）、成骨、成脂、成软骨分化能力的检测（图2）；其中，图1为流式细胞术检测高代次hUC-MSCs细胞表面分子标记，由图可见，经长期传代后，hUC-MSCs表达CD29，CD73，CD90，CD105，HLA-ABC；不表达CD11b，CD19，CD34，CD45，HLA-DR。；其中，图2中A为高代次hUC-MSCs成骨分化能力检测（A）、B为高代次hUC-MSCs成脂能力检测（B）、C为高代次hUC-MSCs软骨分化能力检测。由图2可见，经过长期传代脐带间充质干细胞仍然具有成骨、成脂、成软骨的分化潜能，能够在适当的诱导条件下分化骨、脂肪或软骨细胞。（6）分别提取低代次（P3）和高代次（P30）的基因组DNA，采用aCGH（array-based Comparative Genomic Hybridization）的方法检测低代次和高代次细胞基因组DNA拷贝数（Copy Number Variations，CNVs）的变化。（7）在本次检测的9个脐带间充质干细胞样本中，有7个发生了可检测到的CNVs的变化，有2个未检测到CNVs变化（表1、图3）。我们把在P30检测到10个CNVs以下的样本定义为基因组稳定的样本，把在P30检测到50–100个CNVs的样本定义为基因组不稳定的样本，把在P30检测到100个CNVs以上的样本定义为基因组极不稳定的样本。基因组稳定的样本是适合进行临床试验的间充质干细胞，而基因组不稳定和基因组极不稳定的样本不适合用于临床研究。其中，图3为9个不同供者来源的hUC-MSCs长期传代过程中发生的CNVs在染色体上的展示图。其中，红色三角形表示扩增，绿色三角形表示缺失。横坐标为样本编号。表1.9个不同供者来源的hUC-MSCs样本体外长期传代过程中发现的CNVs片段数样本号传代过程中发生的CNVs片段数11224317847517656728090（8）未检测到CNVs变化的样本为基因组稳定的样本，检测到CNVs突变的样本为基因组不稳定的样本。以上所述仅为本专利技术的较佳实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测间充质干细胞体外传代遗传稳定性的方法，其特征
在于，包括以下步骤：
（1）原代分离间充质干细胞；（2）对原代分离的间充质干细胞
进行短期传代，并冻存建库；（3）对间充质干细胞进行长期传代（4）
提取低代次和高代次的间充质干细胞之基因组DNA；（5）采用高通
量的生物芯片或测序技术，比较高代次和低代次间充质干细胞基因组
DNA的差异；（6）基于高通量分析结果，对低代次的间充质干细胞
基因组体外传代稳定性做出评价。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中短期
传代为进行2-5次传代，传代比例为1:3-1:10。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王有为，韩之波，
申请(专利权)人：北京汉氏联合生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：