本发明专利技术属于生物工程技术领域，特别公开了一种环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法。该方法以环状芽孢杆菌为生产菌种，其特征为，从试管斜面上挑取1-2环环状芽孢杆菌HG12菌体接种到液体种子培养基中，培养制得活化后的液体种子；将液体种子接种量接种到液体发酵培养基中，依次加入木聚糖酶和阿魏酸酯酶，培养制得含有4-乙烯基愈创木酚的发酵液；发酵液经过滤、萃取、静置分相，制得含有4-乙烯基愈创木酚的萃取液，将萃取液真空蒸发，制得4-乙烯基愈创木酚产品。本发明专利技术可以实现4-乙烯基愈创木酚生产的连续化、规模化；并且4-乙烯基愈创木酚的生产工艺简便，生产周期短，生产成本低，极具工业化应用前景。
【技术实现步骤摘要】
（一）
本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法。（二）
技术介绍
4-乙烯基愈创木酚（4-Vinylguaiaco1，4-VG）又名2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、对乙烯基愈创木酚，分子式为C9H10O2，分子量为150.18，为无色或淡黄色的油状液体，略带甜味，呈发酵香气。4-VG是一种能产生特殊香味或丁香类香味的挥发性酚类物质，其感觉阈值很低，仅为0.3mg/L，它能提高食品的感官品质，对酒类、酱油、干酪、饮料等食品的自然香气有很大影响。4-VG是一种常用的高档香料，主要用于食品以增加其香味成份，还用于烟草、日化、医药、香精合成等行业。在酿酒行业，4-VG是以小麦类为原辅料的上面发酵啤酒中必不可少的香味物质，也是酱香型白酒和葡萄酒中的一种重要的风味物质。4-乙烯基愈创木酚的生产方法有从植物中直接提取法、化学合成法和生物合成法三种。植物提取法是从菊科、旋花科等植物中提取，但由于原料供应有限，且植物中4-VG的含量较低，导致提取工艺成本较高而难以实现大规模生产。化学合成法是常用的生产4-VG的方法，如中国专利文献CN 101885669 A（申请号 201010229531.X）公开了一种4-乙烯基愈创木酚的制备方法，步骤为：（1）向反应器中依次投入喹啉、阿魏酸和作为阻聚剂的对苯二酚，加热，温度升高到180-185℃时，反应4-5小时左右；（2）将上述反应液中加入溶剂苯，并加入盐酸，搅拌均匀，静置分层，检测水相pH值为中性为止，最后加入干燥剂无水氯化钙；（3）将干燥后的溶液放入蒸馏器中，常压将作为溶剂的苯蒸出，然后连接上真空泵在100℃以下的气相温度下将产品蒸出，即可包装市售。但化学合成法普遍存在较严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对设备要求较高，生产工艺复杂，产品收率低；并且由于产品中含有原料、副产物、溶剂等物质的残留物，因此该方法得到的4-VG无法直接添加到食品中。随着人们对绿色产品要求的日益提高，利用生物工程技术生产4-VG的方法具有产品绿色天然、安全可靠、反应条件温和、环境污染小等优点而受到人们的重视。生物合成法是通过培养含有阿魏酸脱羧酶的微生物细胞或通过采用阿魏酸脱羧酶制剂进行催化合成4-VG的方法。与植物提取法和化学合成方相比，生物合成法具有原料来源广泛、副产物少、产品收率高、生产成本低、易于实现工业化的特点，是一种经济有效和极有产业化前景的4-乙烯基愈创木酚生产方法。如中国专利文献CN 102776246 A（申请号 201210288911.X）公开了一种生物转化制备天然4-乙烯基愈创木酚的方法，该方法以芽孢杆菌Bacillus sp.HY3CCTCCM2012247为生物催化剂，以天然阿魏酸为底物，通过微生物转化制备天然4-乙烯基愈创木酚。其生产过程包括：（1）斜面培养,（2）制备种子培养液，（3）转化细胞培养,（4）转化。该专利技术是在微生物的作用下将天然阿魏酸转化制备4-乙烯基愈创木酚，但天然阿魏酸是从植物（如谷糠、阿魏等）中提取得到的，由于提取成本较高，因此采用该方法生产4-VG的成本也较高。许多微生物（如参与酒类酿造的酵母菌、细菌、真菌等）能够利用培养基中的营养物质发酵产生4-乙烯基愈创木酚，但由于这些微生物细胞内的阿魏酸脱羧酶活性较低，产生的4-VG含量较低（一般在2.0-5.0mg/L），因而不能满足工业化生产的要求。（三）
技术实现思路
本专利技术为了弥补现有技术的不足，提供了一种产率高、成本低、能够规模化生产的环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，以菌种保藏编号为CGMCC No.8044的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株为生产菌种，包括如下步骤：（1）从试管斜面上挑取1-2环环状芽孢杆菌HG12菌体接种到液体种子培养基中，在35-40℃、120-160r/min条件下，培养12-16h，制得活化后的液体种子；（2）将液体种子按体积比为3-5%的接种量接种到液体发酵培养基中，发酵10-12h，加入木聚糖酶，继续发酵10-12h，加入阿魏酸酯酶，再发酵60-72h制得含有4-乙烯基愈创木酚的发酵液；（3）将发酵液用微孔滤膜过滤，收集滤出液，向滤出液中加入萃取剂，混合均与，静置分相，制得含有4-乙烯基愈创木酚的萃取液，将萃取液真空蒸发，制得4-乙烯基愈创木酚产品。本专利技术涉及的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株是从中国白酒厂酿造酱香型白酒用的高温大曲中分离，并经过紫外线诱变筛选获得，已于2013年8月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC No.8044。本专利技术的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株的微生物学特征是：菌落呈乳白色、有褶皱、无光泽、表面不光滑；菌体呈杆状、直或接近直、单个或成链状，细胞大小约为（0.6-1.0）μm×（1.8-3.8）μm，产芽孢、孢囊膨大、芽孢椭圆形、芽孢中生到端生；革兰氏阳性、兼性厌氧、有机化能异养菌，利用葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖产酸，V-P反应阴性，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，可水解酪蛋白、明胶和淀粉，不利用柠檬酸盐、丙酸盐，在培养温度为55℃下生长；可发酵小麦麸皮、小麦、大麦、高粱的一种或几种组合制成的液体培养基和固态培养基，产生明显的酱香香气。本专利技术的更优方案为：步骤（1）中，液体种子培养基的组分为：葡糖糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH 7.0-7.2，蒸馏水定容。步骤（2）中，液体发酵培养基为：小麦麸皮300g，加水1000mL，混合均匀，于100℃下、蒸煮10-20min，调pH值为6.0-6.5，121℃下、灭菌30min。步骤（2）中，菌体的发酵条件为37-40℃、160-200r/min。步骤（3）中，微孔滤膜的工作压力为0.05-0.1MPa，微孔滤膜的孔径为0.2-0.4μm。步骤（3）中，萃取剂为乙酸丁酯，其用量为滤出液体积比的20-30%。步骤（2）中，木聚糖酶的用量为10.0-20.0U/g麸皮，阿魏酸酯酶的用量为5.0-10.0U/g麸皮。本专利技术使用的环状芽孢杆菌HG12菌株来源于酱香型白酒高温大曲并经过紫外线诱变选育获得；HG12菌株含有高活性阿魏酸脱羧酶，能将发酵液中的阿魏酸脱羧生成4-乙烯基愈创木酚且生成率高；HG12菌株发酵性能优良，其发酵液中的4-乙烯基愈创木酚的浓度高；HG12菌株的发酵产物4-乙烯基愈创木酚符合相关食品安全法规，安全无毒害，属于绿色安全食品。本专利技术采用小麦麸皮为原料，小麦麸皮中含有丰富的阿魏酸，在高温蒸煮以及木聚本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，以菌种保藏编号为CGMCC No.8044的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株为生产菌种，其特征为，包括如下步骤：（1）从试管斜面上挑取1-2环环状芽孢杆菌HG12菌体接种到液体种子培养基中，在35-40℃、120-160r/min条件下，培养12-16h，制得活化后的液体种子；（2）将液体种子按体积比为3-5%的接种量接种到液体发酵培养基中，发酵10-12h，加入木聚糖酶，继续发酵10-12h，加入阿魏酸酯酶，再发酵60-72h制得含有4-乙烯基愈创木酚的发酵液；（3）将发酵液用微孔滤膜过滤，收集滤出液，向滤出液中加入萃取剂，混合均与，静置分相，制得含有4-乙烯基愈创木酚的萃取液，将萃取液真空蒸发，制得4-乙烯基愈创木酚产品。
2.根据权利要求1所述的环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征为，步骤（1）中，液体种子培养基的组分为：葡糖糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH 7.0-7.2，蒸馏水...
【专利技术属性】
技术研发人员：董永胜，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：
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