本发明专利技术涉及基因重组技术领域，尤其涉及一种产5‑酮基米尔贝霉素的链霉菌及生产5‑酮基米尔贝霉素的方法。本发明专利技术提供了一种用于敲除链霉菌milF基因的重组载体，包括milF基因同源片段，该片段的序列为在如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中第158～924位核苷酸间缺失105～767个核苷酸。并提供了该重组载体的构建方法，以及采用该重组载体敲除链霉菌中milF基因的方法，及milF基因被敲除的链霉菌。该链霉菌可以直接发酵产生5‑酮基米尔贝霉素，简化了米尔贝肟的合成工艺，并避免了传统的化学合成方法带来的污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因重组
，尤其涉及一种产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌及生产5-酮基米尔贝霉素的方法。
技术介绍
米尔贝霉素是一种大环内酯类驱虫药物，日本三共株式会社于1967年发现，经过多年的改良于1986年正式以商品名米尔贝肟（milbemycin oxime）上市。米尔贝肟是米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4的肟衍生物，米尔贝肟对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。通常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。由于米尔贝肟杀虫活性高、毒性小，LD50是临床推荐用量的2000倍以上，同时对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，所以具有很好的市场前景。 目前，米尔贝肟是通过半合成的方法生产。首先，产米尔贝霉素的链霉菌经过发酵，从发酵产物中提取得到米尔贝霉素A3和A4。然后米尔贝霉素A3或A4的C-5羟基被氧化成酮。这种5-酮基米尔贝霉素与盐酸羟胺在二噁烷-甲醇-水中发生反应，得到米尔贝肟。 其中，米贝尔霉素A3具有式I所示结构，米贝尔霉素A4具有式II所示结构，5-酮基米尔贝霉素A3的结构如式III所示，5-酮基米尔贝霉素A4的结构如式IV所示。 所述产米尔贝霉素A3和/或A4的链霉菌主要有链霉菌（Streptomyces milbemycinicus）和冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)，冰城链霉菌如(Streptomyces bingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734（亦称Streptomyces bingchenggensis BCW-1）内有基因（GenBank:FJ560599.2），在大肠杆菌中进行表达后的体外实验证明，该基因的表达产物可以将5-酮米尔贝霉素A3和/或A4对应转化为米尔贝霉素A3和/或A4，本专利技术将milF基因定义为泛指：来自于链霉菌、序列与GenBank FJ560599.2高度类似或相同、具有“将5-酮米尔贝霉素A3和/或A4对应转化为米尔贝霉素A3和/或A4”功能的基因；Streptomyces milbemycinicus，如本专利技术的链霉菌HS023亦有milF基因（经本专利技术人测序，序列如SEQ ID NO:2所示，基本与GenBank FJ560599.2同）。显然，能直接产5-酮基米尔贝霉素的菌株，将缩短米尔贝肟的生产工艺，但目前尚未有直接生产5-酮基米尔贝霉素的菌株的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌及生产5-酮基米尔贝霉素的方法，本专利技术采用基因工程的方法，敲除链霉菌中的milF基因，阻止链霉菌代谢产生的5-酮基米尔贝霉素被milF氧化为米尔贝霉素，从而使其能够产5-酮基米尔贝霉素。 本专利技术提供了一种用于敲除产米尔贝霉素A3和/或米尔贝霉素A4的原始链霉菌milF基因的基因敲除质粒，其包含milF基因同源片段，该片段缺失了SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中第158～924位核苷酸间的105～767个核苷酸，本专利技术的“缺失”是指该片段与SEQ ID NO:2相比包含这样的同源序列：该同源序列不含所述SEQ ID NO:2的105～767个核苷酸序列，而SEQ ID NO:2的其他序列均出现在该同源序列中。缺失的片段可为连续的也可为不连续的，本专利技术对此不做限定，其皆在本专利技术的保护范围之内。 作为优选，本专利技术提供的用于敲除链霉菌milF基因的基因敲除质粒，包含抗性标记基因，还包含顺序连接的以下核苷酸片段：上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段； 其中，所述上游核苷酸片段为如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第n～2467个核苷酸，1≤n≤2178，n为整数； 所述milF基因同源片段为在如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中第158～924位核苷酸间缺失105～767个核苷酸的序列； 所述下游核苷酸片段为如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第1～m个核苷酸，997≤m≤3108，m为整数。 本专利技术利用同源重组将基因组中的某段基因替换，而达到基因敲除的目的。本专利技术构建了含有milF基因同源片段及上下游核苷酸片段的基因敲除载体；利用该基因敲除质粒使能够产生米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4的原始链霉菌中的milF基因被milF基因同源片段替换，从而达到敲除链霉菌中milF基因的 目的。 优选的，所述milF基因同源片段的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示： SEQ ID NO:5为在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中缺失第359～646位核苷酸，即288个核苷酸的序列；SEQ ID NO:7为在SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中缺失第158～924位核苷酸，即767个核苷酸的序列；SEQ ID NO:9为在SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中第缺失762～866位核苷酸，即105个核苷酸的序列。 优选的，所述上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段共同形成SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示核苷酸片段。 作为优选，本专利技术提供的基因敲除质粒中抗性标记基因为壮观霉素抗性基因aadA（表达产物起抗壮观霉素的作用）。 在保证各元件功能不发生改变的前提下，壮观霉素抗性基因在本专利技术提供的用于敲除链霉菌milF基因的重组载体中的位置，只要不对敲除结果产生影响，均在本专利技术的保护范围之内。 作为优选，壮观霉素抗性基因为任一含SEQ ID NO：4所示序列的核苷酸片段，如可来自于质粒载体pIJ778。 优选的，壮观霉素抗性基因的制备方法为：取pIJ778质粒载体，经PCR扩增或酶切，即得。 优选的，本专利技术提供的基因敲除质粒的骨架为pMD19（Simple）、pBlueScript SK(+)或pSTV28。 此处骨架意指构建基因敲除质粒所用的起始质粒，该起始质粒的基本结构最终保留在基因敲除质粒中。 本专利技术利用商业化的普通骨架，构建能够敲除链霉菌中milF基因的重组载体，并通过同源重组将原始链霉菌中的milF基因敲除。 优选的，骨架为pMD19（Simple），上游核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，milF基因同源片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，下游核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；壮观霉素抗性基因可以如SEQ ID NO：11所示核苷酸片段的形式，连入最终的基因敲除质粒；顺序连接的上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。 其中，SEQ ID NO：11位于pMD19（Simple）的Ssp I酶切位点处，顺序连接的上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段的位置位于：pMD19（Simple）的EcoR V酶切位点处。 SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为在S本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于敲除产米尔贝霉素A3和/或米尔贝霉素A4的原始链霉菌milF基因的基因敲除质粒，其特
征在于，其包含milF基因同源片段，该片段与SEQ ID NO:2相比，缺失了SEQ ID NO:2所示核苷酸序
列中第158～924位核苷酸间的105～767个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的基因敲除质粒，其特征在于，包含抗性标记基因，还包含顺序连接的以
下核苷酸片段：上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段；
其中，所述上游核苷酸片段为如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第n～2467个核苷酸，1≤n≤
2178，n为整数；
所述milF基因同源片段为在如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中第158～924位核苷酸间缺失105
～767个核苷酸的序列；
所述下游核苷酸片段为如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第1～m个核苷酸，997≤m≤3108，m
为整数。
3.根据权利要求1或2所述的基因敲除质粒，其特征在于，所述milF基因同源片段的序列如SEQ
ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示。
4.根据权利要求3所述的基因敲除质粒，其特征在于，所述上游核苷酸片段、milF基因同源片段、
下游核苷酸片段共同形成SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示核苷酸片段。
5.根据权利要求2所述的基因敲除质粒，其特征在于，所述抗性标记基因为壮观霉素抗性基因。
6.根据权利要求2所述的基因敲除质粒，其特征在于，所述基因敲除质粒的骨架为：pMD19
（Simple）、pBlueScript SK(+)或pSTV28。
7.根据权利要求2所述的基因敲除质粒，其特征在于，所述基因敲除质粒的序列如SEQ ID NO:37、
SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39所示。
8.如权利要求1～7任一项所述的基因敲除质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将抗性标记基因连接入骨架质粒，获得第一载体；
步骤2：以链霉菌总DNA为模板，扩增第一核苷酸片段，将所述第一核苷酸片段连接入所述第一
载体，获得第二载体；
步骤3：取所述第二载体，用限制性内切酶切除所述第一核苷酸片段中milF基因第158～924位核
苷酸间的105～767个核苷酸，制得所述基因敲除质粒；
其中，所述第一核苷酸片段为顺序连接的上游核苷酸片段、milF基因、下游核苷酸片段；
所述上游核苷酸片段为如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第n～2467个核苷酸，1≤n≤2178，n
\t为整数；
所述milF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述下游核苷酸片段为如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第1～m个核...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄隽，徐赛珍，周敏，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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