一种α-环糊精葡萄糖基转移酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种α-环糊精葡萄糖基转移酶基因及其应用；涉及一种从源自于浸麻类芽孢杆菌提取的α-环糊精葡萄糖基转移酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用。本发明专利技术α-环糊精葡萄糖基转移酶基因可与表达载体连接构建得到含有该基因的表达重组质粒(pET-20b(+)/cgt)，再转化至大肠杆菌E.coil?BL21中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌可以分泌表达重组淀粉环糊精葡萄糖基转移酶，以淀粉、糖原、寡聚糖等葡萄糖聚合物为底物，进行生物转化反应制备环糊精。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从源自于浸麻类芽孢杆菌提取的α-环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）基因、编码酶、载体、工程菌及应用。
技术介绍
环糊精葡萄糖基转移酶（EC2.4.1.19，CGTase）是糖基水解酶α-淀粉酶家族（家族13）的重要成员，它是一种关键的胞外表达酶，该酶能将淀粉或者淀粉衍生物通过环化反应生成环糊精（简称CGT）。根据D-呋喃葡萄糖单元个数，环糊精中最常用的有α-、β-、γ-环糊精三种，其对应的环糊精葡萄糖基转移酶也具有三类：α-、β-、γ-CGTases。环糊精葡萄糖基转移酶是一种多功能型酶，它能催化四种不同的反应：三种转糖基反应（歧化反应、环化反应和偶合反应）和水解反应。环糊精葡萄糖基转移酶在表观上显示出外切型主要是由于采用低分子量或者高度支化的淀粉或者糊精作为底物，这些底物比高分子量的直链淀粉更容易发生反应。环糊精葡萄糖基转移酶通过环化反应利用淀粉生产环糊精，作为工业应用的基础，同时也会产生一定量的极限糊精，这种极限糊精可应用于造纸工业中的表面施胶和涂布，施胶或涂布液中加入极限糊精能显著改善纸张的书写性能。产生环糊精葡萄糖基转移酶的微生物种类众多，现在工业上生产环糊精所使用的环糊精葡萄糖基转移酶是来自芽孢杆菌属,包括：1)好氧嗜温细菌，如P.macerans，B.megaterium，B.cereus，B.ohbensis，Klebsiella pneumoniae，K.oxytoca等；2)好氧嗜热细菌，如B.stearothermophilus等；3)厌氧嗜热细菌，如：T.thermosulfurigenes等；4)好氧嗜碱细菌，如：B.circulans，Bacillus sp.，B.clarkii等；5)好氧嗜盐细菌，如：B.halophilus等。环糊精的工业化生产均采用酶法合成,但由于野生菌株的产酶能力普遍较低，CGT的产量远不能满足环糊精工业化生产的要求，同时由于转化率低、提纯制备以及分离困难等原因导致环糊精生产成本太高,其应用受到了很大限制。为了有效降低环糊精的生产成本，大幅度提高CGT产量起着至关重要的作用。由于环糊精分子具有独特的疏水空腔结构，能包含疏水性客体分子，从而改变客体分子的溶解度、稳定性等物理化学性质,因此在食品、医药、农业、纺织、环保、化妆品、生物技术和分析化学等领域具有广泛的应用。但是，CGT在E.coli中表达产物大多是以不溶性包涵体形式存在，而这种包涵体的活化需要复杂的过程,这些都不利于重组CGT的工业化生产。为了克服野生菌株较低CGT酶生产能力，有关CGT酶基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达成为当今研究的热点。因此,采用重组DNA技术生产CGT越来越得到重视，构建高效胞外表达的基因工程菌有着重要的意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种α-环糊精葡萄糖基转移酶基因及其应用，目的是提供一种软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)JFB05-01的α-环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备重组环糊精葡萄糖基转移酶中的应用，环糊精葡萄糖基转移酶制备环糊精的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种来源于软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的α-环糊精葡萄糖基转移酶基因，所述α-环糊精葡萄糖基转移酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，该酶可催化从淀粉出发制备环糊精。所述α-环糊精葡萄糖基转移酶基因可用于构建能够生物催化淀粉制备环糊精的基因工程菌，以提高环糊精的产量。本专利技术提供一种由所述α-环糊精葡萄糖基转移酶基因编码的α-环糊精葡萄糖基转移酶。所述SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。任何对SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得的多肽片段或其变体，只要其与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有95%以上同源性，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术涉及含所述α-环糊精葡萄糖基转移酶基因的重组载体，及用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。本专利技术以蛋白酶K-酚抽提法所得到Paenibacillus macerans基因组DNA（大约2061bp）为模板，根据NCBI报道的环糊精葡萄糖基转移酶基因（GenBank accession no.AF047363.1），设计了具有两个酶切位点（Nco I和EcoR I）的特异性引物：引物1（5’-CCATATGTCCATGGATTCACCCGATACGAGC-3’）和引物2（5’-CTCGAGAGAATTCGGATTTTGCCAGTCCAC-3’）,通过PCR扩增得到α-环糊精葡萄糖基转移酶基因，接着将扩增的不含自身信号肽的α-CGT酶基因与pMD18-T载体连接并转化宿主E.coil JM109,采用蓝白斑筛选后将阳性菌株在含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中培养过夜,提取质粒并采用酶切电泳和测序鉴定。由于P.maceransα-CGT酶基因内部含有一个NcoI位点，本专利技术为了进一步将基因亚克隆到表达载体，以质粒pMD18-T simple/cgt为模板，设计一对互补引物(正向引物3:5’-CAATGTGGGTCCCACaATGGGCCAGCCG-3’和反向引物4:5’-CGGCTGGCCCATtGTGGGACCCACATTG-3’)，采用一步PCR法突变α-CGT酶基因中的NcoI位点,但不改变氨基酸序列。将PCR产物用DpnI处理后转化到宿主E.coli JM109中，挑取单克隆在含有100μg/mL Amp的LB培养基中培养过夜,提取质粒并采用酶切电泳鉴定。将已突变NcoI位点的质粒pMD18-T simple/cgt通过NcoI和EcoRI双酶切后回收目的片段，再与通过同样酶切处理的含有pelB信号肽和His-tag的质粒pET-20b(+)用T4DNA连接酶连接;连接产物转化E.coli JM109,挑取单克隆在含有100μg/mL Amp的LB培养基中培养过夜,提取质粒并采用酶切电泳和测序。本专利技术将α-环糊精葡萄糖基转移酶基因同表达载体pET-20b(+)连接，构建了含有α-环糊精葡萄糖基转移酶基因的胞外表达重组质粒pET-20b(+)/cgt。将胞内表达重组质粒pET-20b(+)/cgt转化至大肠杆菌BL21菌株中，获得含有重组质粒<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种α-环糊精葡萄糖基转移酶基因，其特征在于所述α-环糊精葡萄糖基转
移酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
2.一种由权利要求1所述α-环糊精葡萄糖基转移酶基因编码的α-环糊精葡萄
糖基转移酶。
3.如权利要求2所述的α-环糊精葡萄糖基转移酶，其特征在于所述α-环糊精
葡萄糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
4.一种含权利要求1所述α-环糊精葡萄糖基转移酶基因的重组载体。
5.一种由权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
6.一种权利要求1所述α-环糊精葡萄糖基转移酶基因在制备重组α-环糊精葡
萄糖基转移酶中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：将含所述α-环糊精葡萄糖基转移酶
基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨轶囡，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：