一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法技术

本发明专利技术公开了一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法。本发明专利技术的表皮细胞和真皮细胞来源于胎儿头皮、新生儿包皮或成人头皮，将表皮细胞和真皮细胞分开培养并进行传代，所用的培养基及培养方法能维持皮肤细胞的多功能性；将培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后混合制成悬浮液；然后转移到半渗透性聚合物或硅胶膜底物上进行孵育；然后移植粘附膜上的细胞到受体上。该方法可以再生出人的完整的有功能的皮肤和毛发，再生的皮肤含有表皮层，真皮层和皮下组织及皮肤附属器官。用该技术再生的皮肤和毛发模型可应用于对人皮肤和毛发疾病的研究，对皮肤药物的筛选，还可用于开发细胞产品来治疗创伤、秃顶等皮肤疾病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，本专利技术还涉及该方法制备的皮肤和毛发模型，以及该模型在对人皮肤和毛发疾病的研究，皮肤药物的筛选和开发治疗创伤和秃顶的临床产品方面的应用。属于组织细胞学和组织工程学领域。
技术介绍
长期以来，皮肤学家和皮肤外科医生一直在努力实现能在临床上再生出有完整功能的皮肤，用于治疗皮肤的创伤和消除皮肤疤痕。有很多原因会造成皮肤的损害：比如遗传疾病、烧烫伤、慢性创伤如糖尿病引起的创伤。很多皮肤损害以后自身不能恢复，比如深度的大面积烧烫伤，皮肤大面积损伤后极易引发感染而导致死亡。目前，最普通的治疗方法是用手术移植自身其他部位没有损伤的皮肤到烧烫伤处。然而，这方法有很大局限性，一方面如果大面积烧伤，自身正常皮肤的来源有限；另一方面，移植后的皮肤存活率低也是目前临床面临的重大挑战。所以需要体外培养得技术来扩增细胞用于移植。目前用培养扩增的细胞结合框架蛋白如胶原蛋白一起来形成人皮肤的替代品在临床上代替完整的皮肤移植起着很大的应用价值，但该皮肤替代品只是形成薄薄的表皮和真皮，不能形成皮下组织和皮肤的附属器官像毛发、汗腺等，是没有正常功能的皮肤产品。再比如糖尿病人常见的足部溃疡，由于糖尿病人的微环境导致这种皮肤溃疡很难愈合，目前没有好的方法治疗。组织工程学治疗脱发包含了移植皮肤组织或细胞到目标区域来诱导毛囊形成。毛囊的诱导与生长需要活性上皮细胞与间质细胞之间的持续地相互作用。然而不是所有自毛囊皮层移植所得的细胞都有能力诱导出新毛囊的生成。以往的研究表明，从人体头皮上分离出来的毛囊可以被移植到免疫缺陷的老鼠背上，之后成功地恢复到正常再生循环。通过移植体外培养突变型(TSCII基因缺乏)成纤维细胞形成的人类皮肤替代品而成功再生出毛发。然而，该再生的毛囊不能形成正常的毛干，而形成正常的毛干是判断是否形成成熟毛囊的核心要素之一。其他研究表明，由表皮细胞与间质细胞组成的皮肤替代物可用于移植来促进毛囊形成。由郑等人申请的美国专利2012/0095445，描述了在体外从分离的表皮与真皮细胞中生成毛囊的方法与试剂，这些细胞是单独培养，传代，然后组合形成其后被植入的毛囊。然而，因为毛囊必须在体外形成后再植入，这个过程是受限制的。李等的美国专利(专利号2011/0321180)报道了从新生小鼠新鲜分离的小鼠皮肤干细胞再生成鼠类毛囊。因为新鲜分离细胞的数量是有限的，再生皮肤就需要使用培养扩增的细胞。不幸的是，多能性细胞在培养中经常会导致细胞分化造成所需细胞类型能力的丢失。另外这个专利技术专利没有报道人的皮肤和毛发的再生。这个研究是用的是新鲜分离的老鼠细胞，而不是体外培养的人细胞。总之，在目前，世界上还没有能用体外培养扩增的细胞来再生出完整有功能性并带有成熟毛发的人的皮肤。
技术实现思路
我们专利技术了人类皮肤多功能细胞的分离和培养方法，以及移植该培养的细胞到小鼠身上再生出完整的有功能人类皮肤的技术。该技术包括通过获取多功能表皮和真皮细胞的分离方法、多功能表皮和真皮细胞体外增殖并维持多功能性的培养方法。通过上述技术方法再生的人类皮肤含有带有正常表皮、真皮和一个完整的皮下组织层。该再生的皮肤含所有的皮肤附属品包括毛发、皮脂腺、汗腺、神经和血管。而再生的毛发拥有正常色素并能周期循环生长的成熟的人类毛囊。再生的皮肤在小鼠上所覆盖的面积在0.1～2cm2区域内，每1cm2可产生50-2000个成熟的毛囊。本专利技术的技术方案是：一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）采集源自胎儿头皮、新生儿包皮或成人的头皮的含有多功能表皮和真皮细胞的组织样本；另外来自任何组织的SOX2基因表达的间质细胞和来自任何组织样本有能力形成单克隆的表皮细胞以及冰冻融化后仍可以有能力形成人皮肤的细胞；（2）将采集的新鲜的组织样本用组织消化酶（Dispase蛋白水解酶）于低温4℃过夜进行消化，第二天用机械法分开表皮和真皮部分；（3）将表皮部分剪碎后培育在胰蛋白酶（typsin）中37℃水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离表皮细胞；将真皮部分剪碎后培育在胶原蛋白酶中37℃水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离出多功能真皮细胞；（4）从组织分离后的表皮细胞和真皮细胞分开培养，表皮细胞和真皮细胞可用任何可供细胞自然生长的培养基培养，包括MEM,DMEM,RPMI,F-12，CNT07等结合不同生长因子如纤维细胞生长因子（FGF）,表皮细胞生长因子（EGF）,B27（神经细胞培养）因子和PC-1（原代细胞培养）补充液等；推荐细胞培养基为含谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基；表皮细胞的培养在培养基中另外加入2-10μM Rock蛋白激酶抑制剂如Y-27632来维持表皮细胞的多功能性；表皮细胞和真皮细胞的培养环境应接近人体生理环境，培养基PH值为6-8，优选7.4；细胞的培养温度为30-40℃，优选为35℃-37℃；另外可结合低氧培养（2%-10%）或细胞聚集培养的方法来增强细胞的多功能性，及增加真皮细胞SOX2基因的表达。（5）真皮细胞培养每5天换一次培养液，而表皮细胞每2天换一次培养液；当细胞生长达到在培养器皿80-90%覆盖率就进行传代；真皮细胞按1：3-6比例传代，可传2-6代；表皮细胞按1：2-4的比例传代，至少可传2-4代；（6）培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后以表皮细胞：真皮细胞为1-10：1的数量比在DMEM/F12(1:1)培养液中混合制成混合细胞悬浮液，总体积在100-200微升；混合细胞悬浮液可同时加入其功能性细胞如黑色素细胞，内皮细胞等；然后将混合细胞悬浮液转移到带有3.0μm透气孔径的半渗透性聚合物（如聚对苯二甲酸乙二醇酯膜）或硅胶膜底物上，并于37℃环境中孵育1-2个小时，使细胞完全附着膜上同时也形成细胞聚合群来维持细胞的多功能性；（7）移植细胞到受体：先在受体上切掉一块0.5-2.0平方厘米大小的完整皮肤组织形成无皮肤组织但没损害皮下肌肉组织的创口；然后将附着有真皮细胞和表皮混合细胞液的底物覆盖在整个伤口上，细胞面接触伤口，底物面朝上；并将底物与皮肤缝合，包扎，或者可以将含有传代细胞的混合细胞悬浮液直接注入皮肤或毛发需要的再生部位。通过实验证明将细胞混合物至于伤口处，移植的细胞可自身组织并相互刺激和诱导，促使包括毛囊和相关腺体等人体完整皮肤结构的形成。使用转化生长因子β1抗体和β2抗体（TGF beta1/beta2），促肾上腺皮质激素（本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，包括：（1）获取多功能表皮和真皮细胞；（2）多功能表皮和真皮细胞体外增殖；（3）培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后制成混合细胞悬浮液；然后将混合细胞悬浮液转移到半渗透性聚合物或硅胶膜底物上，并进行孵育，使细胞完全附着膜上同时也形成细胞聚合群来维持细胞的多功能性；（4）移植到受体的方法。

【技术特征摘要】
1.一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，包括：（1）获取多
功能表皮和真皮细胞；（2）多功能表皮和真皮细胞体外增殖；（3）培养增殖后的多功能表皮
细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后制成混合细胞悬浮液；然后将混合细胞悬浮液
转移到半渗透性聚合物或硅胶膜底物上，并进行孵育，使细胞完全附着膜上同时也形成细胞
聚合群来维持细胞的多功能性；（4）移植到受体的方法。
2.如权利要求1所述的一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，
所述步骤（1）为选自胎儿头皮、新生儿包皮或成人的头皮的多功能表皮和真皮细胞；另外来
自任何组织的SOX2基因表达的间质细胞和来自任何组织样本有能力形成单克隆的表皮细胞
以及冰冻融化后仍可以有能力形成人皮肤的细胞。
3.如权利要求2所述的一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，
包括以下步骤：
（1）采集源自胎儿头皮、新生儿包皮或成人的头皮的含有多功能表皮和真皮细胞的组织
样本；
（2）将采集的新鲜的组织样本用组织消化酶于低温4℃过夜进行消化，第二天用机械法
分开表皮和真皮部分；
（3）将表皮部分剪碎后培育在胰蛋白酶中37℃水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来
分离表皮细胞；将真皮部分剪碎后培育在胶原蛋白酶中37℃水浴箱30分钟后用40目孔径过
滤网来分离出真皮细胞；
（4）从组织分离后的表皮细胞和真皮细胞分开培养，表皮细胞和真皮细胞用任何可供细
胞自然生长的培养基培养；所述表皮细胞的培养在培养基中另外加入2-10μM Rock蛋白激酶
抑制剂来维持表皮细胞的多功能性；表皮细胞和真皮细胞的培养环境接近人体生理环境；
（5）真皮细胞培养每5天换一次培养液，而表皮细胞每2天换一次培养液；当细胞生长
达到在培养器皿80-90%覆盖率就进行传代；真皮细胞按1：3-6比例传代，传2-6代；表皮
细胞按1：2-4的比例传代，传2-4代；
（6）培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后以表皮细胞：
真皮细胞为1-10：1的数量比在DMEM/F12培养液中混合制成混合细胞悬浮液；然后将混合
细胞悬浮液转移到带有3.0μm透气孔径的半渗透性聚合物或硅胶膜底物上，并于37℃环境
中孵育1-2个小时，使细胞完全附着膜上同时也形成细胞聚合群来维持细胞的多功能性；
（7）移植细胞到受体：先在受体上切掉一块0.5-2.0平方厘米大小的完整皮肤组织形成
无皮肤组织但没损害皮下肌肉组织的创口；然后将附着有真皮细胞和表皮混合细胞液的底物

\t覆盖在整个伤口上，细胞面接触伤口，底物面朝上；并将底物与皮肤缝合，包扎。
4...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴训伟，布莱恩·马歇尔，
申请(专利权)人：济南磐升生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37