本发明专利技术公开了一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其构建方法和应用，属于遗传工程领域。本发明专利技术以SEQ ID NO.1所示序列为出发序列，将第193位天冬酰胺替换成苯丙氨酸或第206位蛋氨酸替换为苯丙氨酸或第240位赖氨酸替换成精氨酸或第242位丝氨酸替换成谷氨酰胺或丙氨酸或缺失第180位甘氨酸和181异亮氨酸或其任意组合得到的突变体。在此改造条件下，嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶在95℃的半衰期由对照(突变前)例的10min提高到240min。利用此策略可以显著提高淀粉酶的热稳定性，为其工业化生产提供了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种淀粉酶突变体及其方法，具体涉及一种热稳定性提高的酸性淀粉酶突变体及其制备方法。
技术介绍
淀粉酶是最早用于工业生产的酶制剂，是迄今用于最广，产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶具有相当大的工业应用价值，广泛用于酒精、有机酸、氨基酸及纺织等行业。但是来源于野生菌株未经改造的淀粉酶在热稳定性等方面具有一定局限性，限制了其应用范围。因此基于已得到的酸性淀粉酶在大肠杆菌中的表达系统，利用定点突变的手段，对酸性淀粉酶进行分子改造，以得到酶学性质更适合工业应用的酸性淀粉酶。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种热稳定性提高的淀粉酶突变体，对淀粉酶结构域A、B、C内的一个或多个氨基酸进行替换，提高了淀粉酶的热稳定性。所述淀粉酶突变体以SEQ ID NO.1为出发序列，将第193位天冬酰胺替换成苯丙氨酸或第206位蛋氨酸替换为苯丙氨酸或第240位赖氨酸替换成精氨酸或第242位丝氨酸替换成谷氨酰胺或丙氨酸或缺失第180位甘氨酸和181异亮氨酸或其任意组合得到的突变体。所述氨基酸突变体为第193位天冬酰胺替换成苯丙氨酸的突变体。所述氨基酸突变体为第242位丝氨酸替换成谷氨酰胺或丙氨酸的突变体。所述氨基酸突变体为缺失第180位甘氨酸和181异亮氨酸的突变体。所述氨基酸突变体为第193位天冬酰胺替换成苯丙氨酸、第242位丝氨酸替换成谷氨酰胺或丙氨酸、缺失第180位甘氨酸和181异亮氨酸的突变体。能表达上述淀粉酶突变体的载体也属于本专利要求保护的范围。能表达上述淀粉酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系也属于本专利要求保护的范围。本专利技术还提供一种制备所述淀粉酶突变体的方法，是将淀粉酶催化部位一个或多个氨基酸通过PCR或化学合成的方法进行替换。具体而言，是以SEQ ID NO.1为出发序列，将第193位天冬酰胺替换成苯丙氨酸、第206位蛋氨酸替换为苯丙氨酸、第240位赖氨酸替换成精氨酸、第242位丝氨酸替换成谷氨酰胺或丙氨酸、缺失第180位甘氨酸和181异亮氨酸或其任意组合。所述制备所述淀粉酶突变体的方法，具体步骤如下：1)根据嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶序列SEQ ID NO.1所示，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-20b(+)中，构建重组质粒pET-20b(+)-Amy(图1)；2)利用Swiss-model软件对源自嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶进行模拟，获得淀粉酶空间结构；3)通过对淀粉酶的序列以及空间结构进行分析，确定要突变的氨基酸为位点，分别为第193位、第206位、第240位、第242位、第180位及第181位；4)设计突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换或缺失，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；5)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，获得淀粉酶突变体。表1淀粉酶突变引物序列本专利技术提供的酸性淀粉酶突变体热稳定性显著提高，在95℃的半衰期提高到240min，提高了24倍。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该酸性淀粉酶突变体应用于洗涤、织物退浆、淀粉液化、医药、食品等领域，可以在高温酸性环境下高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。附图说明图1：pET-20b(+)-Amy质粒图谱具体实施方式实施例1：淀粉酶热稳定性突变位点分析与方法通过对淀粉酶序列（SEQ ID NO.1）以及3D空间结构进行分析，确定活性中心与酶的热稳定性提高有关的几个氨基酸残基(Asn193、Met206、Lys240、Ser242、Gly180、Ile181)。根据嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶序列，采用化学全合成的方法全合成后，克隆到质粒pET-20b(+)中，构建重组质粒pET-20b(+)-Amy。针对不同位点的定点突变，设计相应的定点突变引物(表1)。利用定点突变引物及重组质粒pET-20b(+)-Amy，对淀粉酶进行定点突变。采用PCR酶，利用突变引物对重组质粒pET-20b(+)-Amy进行扩增。将扩增后的PCR产物用Dpn Ⅰ处理，消化模板。经Dpn Ⅰ处理后的PCR产物直接转化大肠杆菌宿主BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌，诱导表达，获得单点突变后的重组淀粉酶。以单点突变后获得的重组质粒为模板进行下一轮的突变，获得组合突变后的重组淀粉酶。SEQ ID NO.1：1 AlaAlaProPheAsnGlyThrMetMetGlnTyrPheGluTrpTyrLeuProAspAsp20 GlyThrLeuTrpThrLysValAlaAsnGluAlaAsnAsnLeuSerSerLeuGlyIle39 ThrAlaLeuTrpLeuProProAlaTyrLysGlyThrSerArgSerAspValGlyTyr58 GlyValTyrAspLeuTyrAspLeuGlyGluPheAsnGlnLysGlyThrValArgThr77 LysTyrGlyThrLysAlaGlnTyrLeuGlnAlaIleGlnAlaAlaHisAlaAlaGly96 MetGlnValTyrAlaAspValValPheAspHisLysGlyGlyAlaAspGlyThrGlu115 TrpValAspAlaValGluValAsnProSerAspArgAsnGlnGluIleSerGlyThr134 TyrGlnIleGlnAlaTrpThrLysPheAspPheProGlyArgGlyAsnThrTyrSer153 SerPheLysTrpArgTrpTyrHisPheAspGlyValAspTrpAspGluSerArgLys172 LeuSerArgIleTyrLysPheArgGlyLysAlaTrpAspTrpGluValAspThrGlu191 PheGlyAsnTyrAspTyrLeuMetTyrAlaAspLeuAspMetAspHisProGluVal210 ValThrGluLeuLysAsnTrpGlyLysTrpTyrValAsnThrThrAsnIleAspGly229 PheArgLeuAspAlaValLysHisIleLysPheGlnPhePheProAspTrpLeuSer248 TyrValArgSerGlnThrGlyLysProLeuPheThrValGlyGluTyrTrpSerTyr267 AspIleAsnLysLeuHisAsnTyrIleThrLysThrAspGlyTh本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种热稳定提高的淀粉酶突变体，其特征在于以SEQ ID NO.1所示序列为出发序列，将第193位天冬酰胺替换成苯丙氨酸或第206位蛋氨酸替换为苯丙氨酸或第240位赖氨酸替换成精氨酸或第242位丝氨酸替换成谷氨酰胺或丙氨酸或缺失第180位甘氨酸和181异亮氨酸或其任意组合得到的突变体。
【技术特征摘要】
1.一种热稳定提高的淀粉酶突变体，其特征在于以SEQ ID NO.1所示序列
为出发序列，将第193位天冬酰胺替换成苯丙氨酸或第206位蛋氨酸替换为苯丙
氨酸或第240位赖氨酸替换成精氨酸或第242位丝氨酸替换成谷氨酰胺或丙氨酸
或缺失第180位甘氨酸和181异亮氨酸或其任意组合得到的突变体。
2.权利要求1所述淀粉酶突变体，其特征在于第193位天冬酰胺替换成苯
丙氨酸。
3.权利要求2所述淀粉酶突变体，其特征在于第242位丝氨酸替换成谷氨
酰胺或丙氨酸。
4.权利要求1所述淀粉酶突变体，其特征在于缺失第180位甘氨酸和181
异亮氨酸。
5.权利要求1所述突变体，其特征在于第193位天冬酰胺替换成苯丙氨酸、
第242位丝氨酸替换成谷氨酰胺或丙氨酸、缺失第180位甘氨酸和181异亮氨酸。
6.能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的载体。
7.能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的基因工程菌或转基因细胞
系。
8.权利要求1所述淀粉酶突变体的制备方法，其特征在于，将SEQ ID NO.1
所示淀粉酶活性位点内的一个或多个氨基酸通过PCR或化学合成的方法进...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，李祝，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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