本发明专利技术提供了一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的优化基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，该基因可在毕赤酵母表达系统中高效表达，从而制得耐碱高温甘露聚糖酶ManB，该酶在饲料添加剂、保健食品、造纸、洗涤、医药等领域具有广阔的应用前景。本发明专利技术还提供了一种含有该优化基因的重组表达质粒，以及一种生产该耐碱高温甘露聚糖酶ManB的毕赤酵母重组菌株。该菌株所分泌的甘露聚糖酶ManB在发酵液中的蛋白质含量达到电泳纯级别，几乎不需要纯化，降低生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB，以及其编码基因序列重排与优化，包含该酶基因的重组表达载体，及其应用，属于基因工程领域。
技术介绍
甘露聚糖是半纤维素家族的重要成分之一，分为以下四个亚类：直链甘露聚糖，葡甘露聚糖，半乳甘露聚糖，半乳葡甘露聚糖。它们由甘露糖或甘露糖与葡萄糖组合以β-1,4-糖苷键形成骨架，另外半乳糖会以α-1,6-糖苷键连接于骨架上作为侧链。甘露聚糖是软木中半纤维素成分的主要组分，并广泛分布于植物组织中，如角豆胶，魔芋和瓜尔豆胶等。β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）是水解β-1,4-D-吡喃甘露糖为主链的内切水解酶，作用底物主要是甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、以及半乳葡甘露聚糖。β-甘露聚糖酶主要属于糖苷水解酶类第5和26家族，少部分属于第113家族，其中第5家族又分为8个亚类，β-甘露聚糖酶属于第7和8亚类，分别来源于真核生物和细菌，这两个亚类成员之间的序列相似性低于20%（Larsson AM,et al.Three-dimensional crystal structure and enzymic characterization of beta-mannanase Man5A from blue mussel Mytilus edulis.Journal of Molecular biology2006,357:1500-1510.）。随着β-甘露聚糖酶的深入研究，其应用领域也在不断的扩展，并拥有一个广泛的工业酶应用市场，包括食品和饲料，咖啡萃取，生物乙醇生产，杀粘菌剂，制药，纺织，洗涤，造纸，石油，天然气工业，及生物技术等领域。在食品和医疗领域，作为甘露聚糖丰富来源的魔芋粉、角豆胶和瓜尔豆胶等被甘露聚糖酶降解为甘露寡糖后，能够代替蔗糖作为食品添加剂，降低血糖，维持胆固醇平衡，增加肠道益生菌，并促进其生长和繁殖。动物的植物性饲料中添加甘露聚糖酶能破坏细胞壁释放密封的能增高肠壁绒毛的营养物质，水解饲料中甘露聚糖等抗营养因子，降低饲料粘度，从而达到改善饲料吸收率的目的。在纸浆漂白的过程中需要除去木质素，使用甘露聚糖酶不仅能去除该杂质，同时又减少污染。软木是纸浆的主要来源，含有15～20%主要成分为半乳甘露聚糖的半纤维素。这就使得具有该成分特异性的甘露聚糖酶成为软木纸浆漂白的最佳选择。树胶中的甘露聚糖通常被用作冰激凌、调味酱、发胶、护发素等的增稠剂，而甘露聚糖倾向于吸附衣物纤维，因此很难去除含有甘露聚糖的污渍，采用含有耐碱甘露聚糖酶的洗涤剂则可以将其水解为易溶的小分子，使衣物等易漂洗。在石油和天然气工业中，甘露聚糖酶作为钻探过程中的优质生物破胶剂，具有成本低，破坏小，效率高等优点。甘露聚糖酶是天然多糖结构分析和植物细胞破壁的良好工具酶，生成具有增殖双歧杆菌生理功效的低聚糖（Chauhan PS,et al.Mannanases:microbial sources,production,properties and potential biotechnological applications.Applied Microbiology and Biotechnology2012,93:1817-1830.）。来源于细菌的甘露聚糖酶普遍比来源于真菌的甘露聚糖酶具有更高的稳定性，将来源于细菌的甘露聚糖酶基因经序列优化后应用于可高密度培养的毕赤酵母，更适宜于工业化生产。本专利技术中，来源于褐色高温单孢菌Thermomonospora Fusca的甘露聚糖酶1BQC由具有较优良的酶学性质（Hilge M,et al.High-resolution native and complex structures of thermostable beta-mannanase from Thermomonospora fusca-substrate specificity in glycosyl hydrolase family5.Structure.1998,6(11):1433-1444.），属于糖苷水解酶类第5家族，其基因大小为906bp，氨基酸序列大小为302aa，预测其分子量为33.1kDa，其结晶体三维结构等研究深入，便于进行体外突变等进一步研究，且具有宽广的pH耐受范围。
技术实现思路
本专利技术提供了一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的优化基因，该基因可在毕赤酵母表达系统中高效表达，从而制得耐碱高温甘露聚糖酶ManB，该酶在饲料添加剂、保健食品、造纸、洗涤、医药等领域具有广阔的应用前景。本专利技术所提供的耐碱高温甘露聚糖酶ManB的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术还提供了一种含有该优化基因的重组表达质粒。本专利技术还提供了一种生产该耐碱高温甘露聚糖酶ManB的毕赤酵母重组菌株。为实现本专利技术上述目的，本专利技术中所采用的耐碱高温甘露聚糖酶ManB的制备方法的步骤如下：（1）、在不改变甘露聚糖酶1BQC的氨基酸序列的条件下，对其进行基因重排和优化密码子，去除毕赤酵母稀有密码子，并提高mRNA的二级结构稳定性，获得优化的甘露聚糖酶ManB基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；（2）、将步骤（1）中甘露聚糖酶ManB基因的5'端和3'端位置分别设计EcoR I和Not I酶切位点，完成全基因合成后插入表达载体pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-ManB；（3）将步骤（2）中重组质粒pPIC9K-ManB采用Dra I线性化该重组质粒后，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，并筛选获得产酶最高的重组毕赤酵母菌株ManB-GS115；（4）将步骤（3）中重组毕赤酵母菌株ManB-GS115接种于毕赤酵母发酵培养基，并维持甲醇诱导产酶，从而获得甘露聚糖酶ManB。步骤（2）和步骤（4）中所述的甘露聚糖酶ManB被分泌至胞外培养液中。本专利技术中与现有技术相比，具有以下优点：首先依据PDB中发表的来源于褐色高温单孢菌Thermomonospora Fusca的甘露聚糖酶1BQC氨基酸序列（SEQ ID NO.2）与Thermomonospora Fusca YX基因组序列（CP000088.1：3,642,249bp）中预测甘露聚糖酶（AAZ54938.1）的氨基酸序列相似性高达99%，本专利技术为了提高甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达效率，在不改变甘露聚糖酶1BQC氨基酸序列情况下，对预测甘露聚糖酶（AAZ54938.1）基因序列（SEQ ID NO.3）进行序列重排与密码子优化并提高mRNA二级结构稳定性，从而获得优化的甘露聚糖酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、在不改变甘露聚糖酶1BQC的氨基酸序列的条件下，对其进行基因重排和优化密码子，去除毕赤酵母稀有密码子，并提高mRNA的二级结构稳定性，获得优化的甘露聚糖酶ManB基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；（2）、将步骤（1）中甘露聚糖酶ManB基因的5'端和3'端位置分别设计EcoR I和Not I酶切位点，完成全基因合成后插入表达载体pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K‑ManB；（3）将步骤（2）中重组质粒pPIC9K‑ManB采用Dra I线性化该重组质粒后，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，并筛选获得产酶最高的重组毕赤酵母菌株ManB‑GS115；（4）将步骤（3）中重组毕赤酵母菌株ManB‑GS115接种于毕赤酵母发酵培养基，并维持甲醇诱导产酶，从而获得甘露聚糖酶ManB。
【技术特征摘要】
1.一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、
在不改变甘露聚糖酶1BQC的氨基酸序列的条件下，对其进行基因重排和优化密码子，
去除毕赤酵母稀有密码子，并提高mRNA的二级结构稳定性，获得优化的甘露聚糖酶
ManB基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；（2）、将步骤（1）中甘露聚糖酶ManB
基因的5'端和3'端位置分别设计EcoR I和Not I酶切位点，完成全基因合成后插入表达
载体pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-ManB；（3）将步骤（2）中重组质粒pPIC9K-ManB
采用Dra I线性化该重组质粒后，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，并筛选获得产酶最
高的重组毕赤酵母菌株ManB...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊海容，王亚伟，钱国岗，
申请(专利权)人：湖北汇龙食品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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