一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒，由定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、CVA2和CVA5标准品、CVA2和CVA5强阳性对照品、CVA2和CVA5弱阳性对照品、阴性对照品组成。本发明专利技术运用一步法实时荧光定量RT-PCR技术，采用CVA2、CVA5高度特异的引物和荧光标记探针，从粪便标本中同时检测出是否有CVA2、CVA5的存在，比单重荧光定量PCR方法更便捷迅速、节约成本。检测实时、准确定量，为临床提供早期诊断，为临床治疗方案的制定提供参考依据；可应用于柯萨奇病毒A2、A5型引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。

【技术实现步骤摘要】

    本专利技术属生物
，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种一步法双重实时荧光定量RT-PCR在同一个反应管内检测患者粪便标本中柯萨奇病毒A2、A5型的核酸检测方法，可应用于柯萨奇病毒A2、A5型引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。 
技术介绍
手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由人类肠道病毒(human enterovirus， HEV)引起的，以手、足、口、臀部出现皮疹症状为主要临床症状的常见传染病，主要以轻症为主，但重症及死亡病例也时有报道。人类肠道病毒分为A、B、C、D 4个组，目前共有90 多种基因型，其中最主要的病原体是HEV-A组中的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus A16，CVAl6)。但越来越多的研究表明，HEV中的一些其他血清型，如CVA6、CVA10、CVA2、CVA5型等也可引起HFMD。    导致手足口疾病的致病病原的变异变迁必须引起足够的重视。比如，近年来在欧洲及我国周边部分国家爆发的手足口病疫情中，柯萨奇病毒A6型等已经替代EV71和CVA16被作为主要致病病原体检出。2010年，台湾地区的手足口致病病原调查中，柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型有一定比例的检出。2012年，香港地区报道2例柯萨奇病毒A2型引起的儿童死亡。而近年来，在我国的广东深圳和山东临沂等地区的手足口病原中也有柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型检出的报道。在我们实验室开展的2013年部分月份手足口病原调查中，柯萨奇病毒A2型和A5型也占到了一定的比例。目前我国的手足口病病原诊断市场，仍然以检测肠道病毒通用型或肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型为主，导致手足口病病原体检测不明确或漏检等，造成患者治疗的延误及诊断试剂的浪费等。因而开发一种针对柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型病原检测的诊断试剂对明确致病病原有极大的帮助。 实时荧光定量PCR技术以其全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、实时定量、污染少等优势，克服了以往临床诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床诊断提供了准确可靠的实验室依据，可作为一种临床病原诊断的有效、快速的检测手段。 
技术实现思路
    本专利技术的目的是提供一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒，是一种用柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型检测的一步法双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本试剂盒包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品（CVA2、CVA5）、强阳性对照品（CVA2、CVA5）、弱阳性对照品（CVA2、CVA5）、阴性对照品。 其中定量RT-PCR反应液包含有PCR反应缓冲液（含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等），酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含CVA2、CVA5两组引物和相应的CVA2、CVA5两种不同荧光标记的探针，阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，CVA2、CVA5强阳性对照品和CVA2、CVA5弱阳性对照品为包含CVA2、CVA5的保守区基因序列的阳性质粒样品。 引物探针混合液需保存于棕色管。     双重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下： 上游引物CVA2-F: 5’- AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA-3’，下游引物CVA2-R：5’-TACACGCCCRGTCTCAATGG-3’，特异性探针CVA2-P: 5’-FAM- AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC-BHQ1-3’，上游引物CVA5-F: 5’- AAGCGGCGGAGACAGGAG-3’，下游引物CVA5-R: 5’- CCATGCCTGTTGACCACACA-3’，特异性探针CVA5-P: 5’-HEX- CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA-BHQ1-3’，    其中CVA2、CVA5的特异性探针分别采用FAM、HEX两种不同荧光标记。上述CVA2、CVA5标准品的保守区基因序列如下： CVA2标准品序列为：AATGCTACGATAGACAGGGTGTTGAGTCGGCCAGTGTCTCATTCACCAACAGCTGCTAACACCCAGGTGAGCCAGCACTCCATTGAGACTGGGCGTGTACCTGCACTACAAGCTGCTGAAACG；CVA5标准品序列为：ACAGGGCAGGTACCAGCTCTGCAAGCGGCGGAGACAGGAGCGACCTCAAACGCCACCGATGAAAGCATGATTGAAACCAGGTGTGTGGTCAACAGGCATGGGGTTATGGAAACAAGTGTTGAG。   本专利技术提供的荧光定量试剂盒需于-20℃储存，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件保存。 本专利技术的另一个目的是提供上述的一步法双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，应用于柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型的核酸检测。     本专利技术试剂盒的使用方法：在每次标本检测中均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用TaKaRa公司的Easy Dilution（货号：9160）稀释为1×102-1×107copies/ml。 粪便样本核酸的提取：取约0.2g粪便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置10min，以8000r/min离心5min。吸取200 ml上清加入到EP管中，进行核酸提取。核酸提取采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acid extraction KitII或QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit，按照试剂盒说明书进行提取, 取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。     核酸的检测：取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。反应总体积为25 ，其中定量RT-PCR反应液12.5，酶混合液1，引物探针混合液(20μmol/l，包含两组特异性引物和相应的两种荧光探针)共3，模板5，加水补足至25。在ABI7500荧光定量PCR仪（或者其他双色荧光及以上的PCR仪）上进行检测，反应参数为：反转录50℃,30min；95℃ 5min热启动，然后95℃ 15s，55℃ 45s，在55℃进行双重荧光检测，共进行40个循环。     荧光定量结果报告：① 柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A5型检测的各自CT值对应相应的荧光标记的病毒，检测样本CT值为40、0和无数值时，报告为阴性。② 检测样本CT值≤35时，报告为相应病毒阳性。③ 检测样本CT值≥35且小于40的样本，建议复检，复检结果CT值＜38者，依据②的判断标准报告为相应病毒阳性。根据所获得的标准曲线，计算待测标本柯萨奇病毒A2型或者柯萨奇病毒A5型的病毒量(c本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒，其特征在于，本试剂盒由定量RT‑PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、CVA2标准品、CVA5标准品、CVA2强阳性对照品、CVA5强阳性对照品、CVA2弱阳性对照品、CVA5弱阳性对照品、阴性对照品组成，其中定量RT‑PCR反应液包含PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含CVA2、CVA5两组特异性引物和相应的CVA2、CVA5两种荧光标记的特异性探针，阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，CVA2、CVA5强阳性对照品和CVA2、CVA5弱阳性对照品为包含CVA2、CVA5的保守区基因序列的阳性质粒样品；CVA2、CVA5两组特异性引物和CVA2、CVA5两种荧光标记的特异性探针序列如下：上游引物CVA2‑F: 5’‑ AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA‑3’，下游引物CVA2‑R：5’‑TACACGCCCRGTCTCAATGG‑3’，特异性探针CVA2‑P: 5’‑FAM‑ AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC‑BHQ1‑3’，上游引物CVA5‑F: 5’‑ AAGCGGCGGAGACAGGAG‑3’，下游引物CVA5‑R: 5’‑ CCATGCCTGTTGACCACACA‑3’，特异性探针CVA5‑P: 5’‑HEX‑ CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA‑BHQ1‑3’。...

【技术特征摘要】
1.一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒，其特征在于，本试剂盒由定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、CVA2标准品、CVA5标准品、CVA2强阳性对照品、CVA5强阳性对照品、CVA2弱阳性对照品、CVA5弱阳性对照品、阴性对照品组成，其中定量RT-PCR反应液包含PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含CVA2、CVA5两组特异性引物和相应的CVA2、CVA5两种荧光标记的特异性探针，阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，CVA2、CVA5强阳性对照品和CVA2、CVA5弱阳性对照品为包含CVA2、CVA5的保守区基因序列的阳性质粒样品；
CVA2、CVA5两组特异性引物和CVA2、CVA5两种荧光标记的特异性探针序列如下：
上游引物CVA2-F: 5’- AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA-3’，
下游引物CVA2-R：5’-TACACGCCCRGTCTCAATGG-3’，
特异性探针CVA2-P: 5’-FAM- AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC-BHQ1-3’，
上游引物CVA5-F: 5’- AAGCGGCGGAGACAGGAG-3’，
下游引物CVA5-R: 5’- CCATGCCTGTTGACCACACA-3’，

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑜，李兰娟，谢国良，崔大伟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33