一种检测呋喃丹的快速检测试剂板的制备方法技术

本发明专利技术是一项检测呋喃丹的快速检测试剂板的制备方法。主要检测农作物及林木等是否有呋喃丹残留。本产品主要由上下两块塑料卡壳，试纸条组成。其中，试纸条的底层为支撑层。中间层为吸附层，固定在支撑层上；外层为保护层，固定在吸附层上，吸附层从测试样品端依次为纤维层，吸附偶联呋喃丹的金标载体蛋白纤维层，NC膜层，手柄端的吸水材料层，在NC膜层上有用呋喃丹的载体蛋白溶液划的检测印迹，称T线，用羊抗兔抗抗体溶液划对照印迹，称C线。最后的测试结果由C线和T线所显得颜色判断。本产品具有成本低，方法快速、简便，准确率高等特点。适合企业进行大规模的样品快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品安全检测领域，具体涉及检测稻、棉、玉米、高粱、甜菜、甘蔗、烟草、大豆、花生等作物以及林木、花卉上是否含有呋喃丹的残留。
技术介绍
呋喃丹是氨基甲酸酯类杀虫剂和杀线虫剂。1963年由美国创制，1967年推广。纯品为白色结晶，25℃时水中溶解度为700 ppm，在中性和酸性条件下较稳定，在碱性介质中不稳定，水解速度随pH值和温度的升高而加快。在水田中半衰期为1～2天，土壤中为30～60天。呋喃丹是内吸剂，兼有触杀作用，能被植物根、茎、叶吸收，并在体内传导。多施于土壤防治害虫。杀虫谱广，对稻、棉、玉米、高粱、甜菜、甘蔗、烟草、大豆、花生等作物以及林木、花卉上的多种害虫和线虫有效，但对稻纵卷叶螟效果差。持效期长，一般可达30～40天。剂型主要是颗粒剂。防治地上害虫亩用有效成分35～60克；防治地下害虫和线虫亩用200～250 g。稻田多用土壤或水面施药法；防治旱田作物害虫和地下害虫、线虫时随种子播入土中；作物生长期可条施或沟施入土中。颗粒剂不能浸水后喷雾。呋喃丹口服毒性大，皮肤接触毒性小，对人的中毒作用在于它抑制胆碱酯酶，硫酸阿托品可作为解毒剂。使用时的安全间隔期一般为21天。对鱼和其他水生动物有剧毒。 呋喃丹主要抑制体内胆碱酯酶活性，使乙酰胆碱在组织中蓄积而引起中毒。作用机制和有机磷农药中毒相似。中毒表现有流涎、流泪、瞳孔缩小及痉挛。但与有机磷农药相比，抑制胆碱酯酶的作用持续的时间较短。停止接触后，胆碱酯恢复较快。其毒性经口属剧毒类；经皮属中等毒类。呋喃丹属高毒农药，对环境生物毒性也很高。在各种环境生物中，呋喃丹对鸟类的危害性最大，一只小鸟只要觅食一粒呋喃丹足以致命。受呋喃中毒致死的小鸟或其它昆虫，被猛禽类、小型兽类或爬行类动物觅食后，可引起二次中毒而致死。在美国曾发现30余起猛禽（鹰、隼、秃鹫）遭呋喃丹二次中毒事故。呋喃丹的另一个环境行为特点是它在土壤中的残留期较长（降解半衰期为1～2个月）、在土壤中的移动性能较大（水溶解度为700 mg/L），在降水量大、地下水位浅的砂土地区易引起对地下水的污染，为此美国对呋喃丹使用作了一些区易引起对地下水的污染，为此美国对呋喃丹使用作了一些地区性限制。呋喃丹遇明火、高热可燃。受热分解放出有毒的氧化氮烟气。其燃烧（分解）产物有一氧化碳、二氧化碳、氧化氮。 
技术实现思路
本专利技术是一项针对粮食农作物及林木中的呋喃丹残留所开展研究，目的是为了克服现有技术的不足，提供一种特异性强，灵敏度高，且操作简单方便，适用于现场快速筛选呋喃丹阳性样本，只需对样品经过简单处理即可检测的呋喃丹快速试纸定量检测方法。本专利技术所制作的免疫胶体金检测试剂板主要由上下两块塑料卡壳，试纸条组成。试纸条包含样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸。NC膜上划有检测线（T线），质控线（C线）。试剂条上依次紧密粘贴着样品垫、金标垫，NC膜和吸水纸。其中样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸相邻之间有2 mm的重叠。其作用有两方面：第一是为了使样品溶液和样品垫之间有充分的反应时间，样品垫上的缓冲体系可以中和样品溶液的酸碱度，保证样品溶液中的有效成分与金标垫上的抗体顺利结合；另一方面是为了让样品溶液顺利通过NC膜的孔，一直延展到吸水纸；金标垫上包被有呋喃丹抗体与胶体金的结合物，检测线和质控线上分别划有呋喃丹载体蛋白偶联物和羊抗兔抗抗体。本专利技术所制备的快速检测试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标垫上的抗体反应显色，快速的检测粮食中的呋喃丹残留。若是样品溶液中含有呋喃丹，呋喃丹先和金标垫上的抗体先结合，直至扩散到检测线。因为金标垫上的抗体活性位点因被样品溶液中的呋喃丹载体蛋白偶联物占据而无法与检测线上呋喃丹特异性抗原结合。当样品中的呋喃丹含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色比质控线显色浅甚至不显色，此时结果为阳性。反之，当样品中呋喃丹含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相近或偏深，判定为阴性。本专利技术制备的免疫胶体金快速检测试剂板，试剂板的各部分组成成分与功能如下：1、塑料卡壳：起固定试纸条及标示功能区，显示加样孔，标示检测线、质控线；2、试纸条为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸和其他配件；3、样品垫由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液的作用；4、金标垫由玻纤制成，其上标记有抗呋喃丹抗体与胶体金的结合物，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所；5、NC膜部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来；6、吸水纸为较厚的滤纸，其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。本专利技术试剂板具有如下有益效果：(1)特异性好。本专利技术试剂板的抗呋喃丹抗体对呋喃丹的交叉反应率均为100%，与其他种类的杀虫剂没有交叉反应；(2)操作简便快速。本专利技术试剂板将免疫层析反应所需的大部分原料已整合到试剂条中，滴样后抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短了检样时间，滴样后5-8 min内即可读取结果。本专利技术试剂板的操作不需任何专业培训，普通人员均可操作，只需按说明滴样后用肉眼判读即可；(3)不依赖于实验设备。本专利技术试剂板在直接滴样跑板后，通过肉眼判断NC膜上检测线和质控线的颜色深浅对比来判读结果，整个检测过程无需用到任何实验设备，适合于野外及现场操作，易于推广；(4)成本低，效益好。本专利技术试剂板生产工艺简单，可实现单个样本检测，生产成本低，大大降低了检测费用。附图说明附图1为本专利技术检测试纸条的结构示意图：图中1为样液吸收部分 2为胶体金标记部分 3为检测反应部分 4为检测线 5为参考线 6为吸水部分。附图2检测呋喃丹的快速检测试剂板的检测结果示意图，A阴性显示，B阳性显示，C无效显示。具体实施方式1、胶体金溶液的制备所需胶体金颗粒的平均大小为30 nm，其制备方法为：制备1 L，量取超纯水900 mL于锥形烧瓶中，加热至沸腾。再加入20 mL HAuCl4溶液，加热至激烈沸腾后又加入20 mL柠檬酸钠溶液等颜色转成红色后再继续加热15 min，冷却至室温后用超纯水定容至1 L，放入4℃冰箱保存。2、金标垫的制备取已制备好的胶体金溶液100 mL，用0. l moL/L碳酸钾溶液调pH到8. 0。边搅拌边加入2 mg抗呋喃丹单抗，搅拌20 min，20000 r/min 离心15 min，弃上清液，加入l0 mL pＨ7. 4的PBS缓冲液清洗2次。将沉淀用l0 mL含2 % BSA的PBS缓冲液(pH 7. 4)溶解，用0.22 μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。3.呋喃丹半抗原的制备，呋喃丹-BSA偶联物的制备，呋喃丹抗体的制备。（1）呋喃丹半抗原的制备一种吠喃丹半抗原，其特征在于分子结构为：NC为从1至20的任意自然数一种呋喃丹半抗原的制备方法，其特征在于它的步骤为：①呋喃酚1份溶解在1~4份甲苯中，通入光气1~2份，加氢氧化钠至溶液呈碱性，反应温度为-10~10℃，反应得到一混合物；本文档来自技高网...

【技术保护点】
这是一项检测稻、棉、玉米、高粱、甜菜、甘蔗、烟草、大豆、花生等作物以及林木、花卉上是否有呋喃丹残留的快速检测试剂板的制备方法，其特征是NC膜上贴有包被了呋喃丹抗体的胶体金金标垫；从样品垫到吸水纸方向依次为检测线和质控线，上面分别划有呋喃丹载体蛋白偶联物和羊抗兔抗抗体。

【技术特征摘要】
1.这是一项检测稻、棉、玉米、高粱、甜菜、甘蔗、烟草、大豆、花生等作物以及林木、花卉上是否有呋喃丹残留的快速检测试剂板的制备方法，其特征是NC膜上贴有包被了呋喃丹抗体的胶体金金标垫；从样品垫到吸水纸方向依次为检测线和质控线，上面分别划有呋喃丹载体蛋白偶联物和羊抗兔抗抗体。
2.如权利要求书第一条所述的试剂板制备方法，其特征在于将胶体金与呋喃丹抗体按一定比例混合标记，使其形成稳定的金颗粒，制作成金标垫。
3.如权利要求书第一条所述的试剂板制备方法，本实用新型发明中检测用抗原是呋喃丹与载体物质形成的偶合物，其中载体物质包括蛋白质、蛋白质片段、合成多肽、半合成多肽、多糖，如血清白蛋白、球蛋白、脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖，示例性的载体物质包括牛血清白蛋白、卵清...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜道林，祝文珍，吴湾湾，
申请(专利权)人：江苏维赛科技生物发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32