促进β-β交联的制备含热稳定的氧载体的组合物的方法技术

本发明专利技术提供有利于β-β交联的制备含热稳定的基于血红蛋白的氧载体的药物组合物的方法。使用本发明专利技术的方法，可控制得到的分子的氧亲和力，从而使得可产生经调整用于特定应用的基于血红蛋白的氧载体。较低氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要快速组织氧合的应用(例如出血性休克)，而较高氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要较慢氧合速率的应用(例如癌症辅助疗法)。产生了高度纯化的和热稳定的交联非聚合的四聚血红蛋白，所述四聚血红蛋白具有大于40-60％的β-β交联并且适用于哺乳动物而不会引起肾损伤和血管收缩。进行高温和短时间(HTST)热加工步骤以有效地去除任何不需要的二聚血红蛋白、未交联的四聚血红蛋白和血浆蛋白质杂质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】著作权声明/许可本专利文献的部分公开内容含有受著作权保护的内容。著作权所有者不反对任何人对本专利文件或专利公开内容如其在美国专利和商标局的专利文件或档案中所出现的那样进行原样复制，然而在其它情况下保留所有著作权权利。以下声明适用于如下文和其附带的附图中所述的方法、实验和数据：版权2011，Billion King Intemational有限公司，保留著作权所有。相关申请的交叉参考本申请是国际专利申请，本申请要求于2011年8月31日提交的临时美国专利申请61/529,279、2011年9月6日提交的美国部分接续申请13/225,797和2011年10月18日提交的现为专利US8,106,011的美国部分接续申请13/275,366的优先权，这些申请的全部公开内容均以引用方式并入本文中。
本专利技术涉及有利于β-β交联的制备含热稳定的氧载体的药物组合物的方法。使用本专利技术的方法，可控制得到的分子的氧亲和力，从而使得可产生经调整用于特定应用的基于血红蛋白的氧载体。较低氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要快速组织氧合的应用(例如出血性休克)，而较高氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要较慢氧合速率的应用(例如癌症辅助疗法)。
技术介绍
血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统与组织之间的气体交换发挥重要作用。其负责通过血液循环将氧从呼吸系统运送到体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳从体细胞运离到呼吸系统，在此处呼出二氧化碳。由于血红蛋白具有此氧运输特征，因此如果其可以在离体状态下被稳定化并且在体内使用，则可将其用作有效的氧供体。天然存在的血红蛋白是在红细胞内存在时通常稳定的四聚体。然而，当天然存在的血红蛋白从红细胞中去除时，其在血浆中变得不稳定并且分裂成两个α-β二聚体。这些二聚体中的每一个的分子量约为32kDa。这些二聚体在经肾脏过滤并排泄时可导致实质性肾损伤。四聚体键的断裂也会负面地影响循环中的功能性血红蛋白的持续性。为了解决所述问题，最近在血红蛋白加工方面的发展已经引入了各种交联技术来产生四聚体内的分子内键以及四聚体之间的分子间键，从而形成聚合血红蛋白。现有技术教导聚合血红蛋白是增加血红蛋白的循环半衰期的优选形式。然而，本专利技术人确定，聚合血红蛋白在血液循环中更容易转化成高铁血红蛋白。高铁血红蛋白不能结合氧，并且因此不能氧合组织。因此，现有技术所教导的导致形成聚合血红蛋白的交联是有问题的。在本领域中需要允许分子内交联从而产生稳定的四聚体而不同时形成聚合血红蛋白的技术。现有技术为稳定血红蛋白而进行的尝试所存在的其它问题包括产生包含不可接受的高百分比的二聚体单元的四聚血红蛋白(或如果给予患者则会快速解离成二聚血红蛋白的未交联的四聚血红蛋白)；二聚体的存在使血红蛋白组合物不能令人满意地给予哺乳动物。二聚形式的血红蛋白可导致哺乳动物机体的严重肾损伤；此肾损伤可严重到足以导致死亡。因此，在本领域中需要在终产物中产生具有检测不到的二聚形式的稳定的四聚血红蛋白。现有技术血红蛋白产物的另一问题是在给予后血压突然升高。过去，已经从较早一代的基于血红蛋白的氧载体记录到血管收缩事件。因此，在本领域中需要制备在向哺乳动物施用时不会引起血管收缩和高血压的血红蛋白的方法。现有技术为产生稳定血红蛋白而进行的尝试所存在的其它问题包括存在可导致哺乳动物的过敏效应的蛋白质杂质，例如免疫球蛋白G。因此，在本领域中需要可产生无蛋白质杂质的稳定四聚血红蛋白的方法。除上述问题以外，在本领域中还需要无二聚体、无磷脂并且能够以工业规模产生的稳定化的四聚血红蛋白。基于血红蛋白的氧载体可用于众多种医学应用；根据医学应用，需要不同水平的氧亲和力。例如，具有低氧亲和力的血红蛋白分子可比具有较高氧亲和力的血红蛋白分子更容易将氧转移到靶组织。因此将需要控制交联四聚血红蛋白的氧亲和力。因此，在本领域中需要控制交联类型和交联条件以产生具有精确氧结合水平的交联四聚血红蛋白。
技术实现思路
本专利技术提供了加工非聚合的、热稳定的、纯化的交联四聚血红蛋白的方法，所述交联四聚血红蛋白适用于哺乳动物而不会导致严重的肾损伤、血管有害作用和包括死亡在内的严重不良事件。本专利技术去除了二聚形式的血红蛋白、未交联的四聚血红蛋白、磷脂和蛋白质杂质。本专利技术还提供通过控制四聚体中的交联类型(例如，四聚体中的β-β交联、α-α交联、α-β交联的量)、四聚体的四级结构和交联条件来控制得到的交联四聚体的氧亲和力的技术。较低氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要快速组织氧合的应用(例如出血性休克)，而较高氧亲和力的交联血红蛋白可用于需要较慢氧合速率的应用(例如癌症辅助疗法)。另外，本专利技术使用(1)快速细胞裂解装置用于精确的和受控的低渗裂解；(2)流通柱色谱(flowthrough column chromatography)；(3)高温短时间(HTST)装置用于在纯化过程中热加工血红蛋白溶液以去除不需要的不稳定的血红蛋白二聚体并去除蛋白质杂质，例如免疫球蛋白-G，使得可避免肾损伤、血管有害作用和其它毒性反应；和(4)气密的输液袋包装以避免氧侵入到终产物中。所述方法包括哺乳动物全血的起始材料，所述全血至少包含红细胞和血浆。将哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离，随后过滤以获得滤过的红细胞级分。洗涤滤过的红细胞级分以去除血浆蛋白质杂质。在快速细胞裂解装置中通过受控低渗裂解，持续足以裂解红细胞而不裂解白细胞的时间，来破裂洗涤过的红细胞。进行过滤以从裂解产物中去除至少一部分废滞留物。从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液。对所述血红蛋白溶液进行一个或多个纯化过程，例如超滤和/或色谱。通过富马酸双-3，5-二溴水杨酸酯(DBSF)使纯化的血红蛋白交联以形成热稳定的交联血红蛋白而不形成聚合血红蛋白，使得得到的非聚合的交联四聚血红蛋白的分子量为60-70kDa。如本文中所使用，表达“非聚合的”是指不与其它血红蛋白分子或任何其它非血红蛋白分子(例如PEG)发生分子间交联的四聚血红蛋白。根据血红蛋白源、血红蛋白的四级结构和交联条件，可产生具有高百分比β-β交联的四聚产物。此外，可控制得到的分子的氧亲和力从而使得可产生经调配用于特定应用的基于血红蛋白的氧载体。依照此程序，对交联血红蛋白进行热处理以去除任何残留的未交联的四聚血红蛋白和任何未稳定化的血红蛋白(例如二聚形式的血红蛋白)和任何其它蛋白质杂质。在热处本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，该含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白基本上由具有高于40％的β‑β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述方法包括：a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；b)将所述哺乳动物全血中的所述红细胞与所述血浆分离；c)过滤与所述血浆分离的所述红细胞以获得滤过的红细胞级分；d)洗涤所述滤过的红细胞级分以去除血浆蛋白质杂质，得到洗涤过的红细胞；e)破裂所述洗涤过的红细胞以产生包含破裂的红细胞的裂解产物的溶液；f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废滞留物；g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液；h)进行至少一个纯化过程以去除病毒、废滞留物或蛋白质杂质中的一种或多种；i)在氧合环境中通过富马酸双‑3，5‑二溴水杨酸酯使所述第一血红蛋白溶液交联以形成交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白是具有至少40％β‑β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白；j)去除任何残留的化学品；k)在脱氧环境中热处理所述交联血红蛋白以使任何残留的未稳定化的/未交联的血红蛋白、任何二聚血红蛋白和任何其它蛋白质杂质变性并沉淀，从而使得得到的热稳定的交联四聚血红蛋白具有检测不到浓度的二聚体并且基本上由非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述非聚合的交联四聚血红蛋白具有至少40％的β‑β交联且其氧亲和力大于在基本上类似的条件下测量的相同物种的天然血红蛋白的氧亲和力；l)通过离心或过滤去除沉淀以形成澄清溶液；和m)将纯化的和热稳定的交联四聚血红蛋白添加到药物上可接受的载体。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.08.31 US 61/529,279;2011.09.06 US 13/225,797;1.一种制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方法，该
含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白基本上由具有高于
40％的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述方法包括：
a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；
b)将所述哺乳动物全血中的所述红细胞与所述血浆分离；
c)过滤与所述血浆分离的所述红细胞以获得滤过的红细胞级分；
d)洗涤所述滤过的红细胞级分以去除血浆蛋白质杂质，得到洗涤过的
红细胞；
e)破裂所述洗涤过的红细胞以产生包含破裂的红细胞的裂解产物的
溶液；
f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废滞留物；
g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液；
h)进行至少一个纯化过程以去除病毒、废滞留物或蛋白质杂质中的一
种或多种；
i)在氧合环境中通过富马酸双-3，5-二溴水杨酸酯使所述第一血红蛋
白溶液交联以形成交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白是具有至少40％
β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白；
j)去除任何残留的化学品；
k)在脱氧环境中热处理所述交联血红蛋白以使任何残留的未稳定化
的/未交联的血红蛋白、任何二聚血红蛋白和任何其它蛋白质杂质变性并

\t沉淀，从而使得得到的热稳定的交联四聚血红蛋白具有检测不到浓度的二
聚体并且基本上由非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述非聚合的交联四
聚血红蛋白具有至少40％的β-β交联且其氧亲和力大于在基本上类似的
条件下测量的相同物种的天然血红蛋白的氧亲和力；
l)通过离心或过滤去除沉淀以形成澄清溶液；和
m)将纯化的和热稳定的交联四聚血红蛋白添加到药物上可接受的载
体。
2.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药
物组合物的方法，其中热加工步骤是在约70℃到95℃进行30秒到3小时
的高温短时间(HTST)过程，随后立即冷却且在所述冷却后立即添加0.2％
到0.4％的量的N-乙酰基半胱氨酸。
3.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药
物组合物的方法，其中所述全血是牛全血且所述β-β交联高于50％并且
p50值小于约23mm Hg。
4.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药
物组合物的方法，其中所述全血是牛全血且所述β-β交联高于60％并且
p50值小于约23mm Hg。
5.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药
物组合物的方法，其中所述纯化是使用色谱进行的，所述色谱包括使用一
个或多个阳离子交换柱或阴离子交换柱。
6.根据权利要求5所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药
物组合物的方法，其中所述色谱柱是一个或多个DEAE、CM和/或羟磷灰

\t石柱。
7.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药
物组合物的方法，其中所述全血是人血。
8.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药
物组合物的方法，其中所述全血是猪血、马血或犬血。
9.根据权利要求1所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药
物组合物的方法，其进一步包括在低透氧性包装中包装所述血红蛋白溶液
以使得血红蛋白溶液具有约两年的保存期限。
10.一种包含血红蛋白的含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组
合物，其中所述血红蛋白基本上由通过权利要求1所述的方法形成的具有
高于40％的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成。
11.一种包含血红蛋白的含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组
合物，其中所述血红蛋白基本上由通过权利要求4所述的方法形成的具有
高于60％的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成。
12.根据权利要求10所述的组合物，其用于氧合组织，其中所述组
合物被体内或离体施用。
13.根据权利要求11所述的组合物，其用于氧合组织，其中所述组
合物被体内或离体施用。
14.一种制备含高度纯化的和热稳定的氧载体的药物组合物的方
法，该含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白基本上由具有
高于50％的β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述方法包括：
a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；
b)将所述哺乳动物全血中的所述红细胞与所述血浆分离；
c)过滤与所述血浆分离的所述红细胞以获得滤过的红细胞级分；
d)洗涤所述滤过的红细胞级分以去除血浆蛋白质杂质，得到洗涤过的
红细胞；
e)破裂所述洗涤过的红细胞以产生包含破裂的红细胞的裂解产物的
溶液；
f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少一部分废滞留物；
g)从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液；
h)进行至少一个纯化过程以去除病毒、废滞留物或蛋白质杂质中的一
种或多种；
i)在脱氧环境中通过富马酸双-3，5-二溴水杨酸酯使所述第一血红蛋
白溶液交联以形成交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白是具有至少50％
β-β交联的非聚合的交联四聚血红蛋白；
j)去除任何残留的化学品；
k)在脱氧环境中热处理所述交联血红蛋白以使任何残留的未稳定化
的/未交联的血红蛋白、任何二聚血红蛋白和任何其它蛋白质杂质变性并
沉淀，从而使得得到的热稳定的交联四聚血红蛋白具有检测不到浓度的二
聚体并且基本上由非聚合的交联四聚血红蛋白组成，所述非聚合的交联四
聚血红蛋白具有至少50％的β-β交联且其氧亲和力小于在基本上类似的
条件下测量的相同物种的天然血红蛋白的氧亲和力；
l)通过离心或过滤去除沉淀以形成澄清溶液；和
m)将纯化的和热稳定的交联四聚血红蛋白添加到药物上可接受的载

\t体。
15.根据权利要求14所述的制备含高度纯化的和热稳定的氧载体
的药物组合物的方法，其中所述全血是牛全血且所述交联四聚牛血红蛋白
的氧亲和力具有约38mm Hg到50mm Hg的p5...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄炳镠，郭瑞仪，毕国珠，
申请(专利权)人：亿京国际有限公司，
类型：发明
国别省市：香港;HK