靶向EGFR的重组蛋白光敏剂及其制备方法，涉及基因工程技术和抗肿瘤生物药物领域。本发明专利技术提供的重组蛋白质从N端到C端依次为表皮生长因子EGF干扰序列（从1到20共20个氨基酸）—linker蛋白序列（从21到35共15个氨基酸序列）—藻蓝蛋白α亚基序列（从36到194共159个氨基酸序列）—含有6×His标签序列（从195到200共6个氨基酸序列）。该蛋白可以直接靶向高表达EGFR的肿瘤细胞表面，在630nm激光照射20min，表现出较强的光致杀灭肿瘤细胞效应，抑制率达到95%；该蛋白表达量高，易于纯化，性能稳定，不含有机溶剂，靶向性好，是一种全新的融合蛋白光敏剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术中重组蛋白领域，具体涉及一种重组蛋白光敏剂的制备方法。
技术介绍
我国每年肿瘤发病率超过260万，平均每2.5min就有一个人死于肿瘤,因次肿瘤成为严重威胁人类健康的一种高发病。光动力学治疗是现代无偿治疗的最新进展，以安全、有效、毒副作用小和成本相对较低而收到临床治疗的青睐，1996年美国批准光动力学治疗用于临床，中国于2003年批准用于临床。决定光动力学治疗效果的关键因素在于光敏剂，由于肿瘤组织对光敏剂只是相对的选择性吸收，并不具备特异性，所以正常组织中不可避免地潴留有少量的光敏剂，可能产生光毒副作用，因此需要开发靶向光敏剂。目前常用的靶向光敏剂通过为化学偶联法得到，其不足之处在于产量低，成本高、活性低、有可能引入有机溶剂而增加毒副反应等。 藻蓝蛋白只有结合了色基才具有光学活性，因而可以用于肿瘤光动力学治疗和诊断以及免疫学等医学研究的藻胆蛋白必须结合有色基。色基生成和连接到脱辅基蛋白的过程是一系列酶促反应过程 (Tooley et al., 2001; Fairchild & Glazer, 2001)。此前，我们成功克隆了基因cpcE、cpcF、ho1及pcyA，构建了载体pCDF -cpcE-cpcF, ho1-pcyA (V1)，最终获得了具有光学活性的藻蓝蛋白及别藻蓝蛋白α亚基。
技术实现思路
本专利技术的目的是提高一种靶向向EGFR的重组蛋白光敏剂及其制备方法。 本专利技术是靶向向EGFR的重组蛋白光敏剂及其制备方法，靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，该光敏剂是通过将6×His蛋白纯化标签、EGFR干扰序列、linker蛋白、集孢藻PCC7120藻蓝蛋白α进行融合，构建融合蛋白光敏剂，经过发酵和纯化后，去除6×His标签，获得可以靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，经630nm光照后可以杀灭肿瘤细胞。 靶向EGFR的重组蛋白光敏剂的制备方法，其步骤为： （1）设计引物EGFRi1和EGFRi2，即序列3和序列4，linker1和linker2，即序列5和序列6，以及PCα1和PCα2，即序列7和序列8；（2）从培养的集孢藻PCC7120中提取总DNA，利用PCR的方法克隆藻蓝蛋白α亚基基因PCα；（3）以EGFRi1和EGFRi2为引物进行重叠延伸PCR扩增，得到EGFRi－linker1核苷酸序列；（4）以linker1和linker2为引物进行重叠延伸PCR扩增，得到linker2-PCα1核苷酸序列；（5）以EGFRi-linker1和linker2-PCα1为模版，以EGFRi1和linker2为引物进行PCR扩增，得到EGFRi-linker-PCα1核苷酸序列；（6）以EGFRi-linker-PCα1和PCα为模版，以EGFRi1和PCα2为引物得到完整的融合蛋白基因序列，融合序列全长600BP；（7）将融合基因序列克隆入表达载体pCDF -cpcE-cpcF, ho1-pcyA 载体，构建pCDF-pcα-cpcE-cpcF，ho1-pcyA转化DH5α；（8）培养重组菌种8h，诱导表达12h，超声破碎菌体，用镍亲和色谱柱纯化蛋白，用TAGZyme去除6×His标签，得到纯化的重组蛋白光敏剂。 本专利技术将EGFR的干扰序列和藻蓝蛋白融合，克隆入pCDF-cpcE-cpcF，ho1-pcyA (V1)载体，构建具有靶向EGFR作用的重组蛋白光敏剂。 重组蛋白光敏剂可无需引入有机溶剂、不会使蛋白变性、产量高、成本低，可以克服化学偶联光敏剂的不足。本专利利用EGFR的干扰序列和藻蓝蛋白构建重组蛋白类光敏剂，改善光动力学治疗的应用效果。 附图说明图1是靶向EGFR的重组蛋白光敏剂基因PCR产物凝胶电泳图，图2是靶向EGFR的重组蛋白光敏剂SDS-PAGE电泳图，图3是靶向EGFR的重组蛋白光敏剂的紫外吸收光谱，图4是靶向EGFR的重组蛋白光敏剂荧光发射光谱，图5是镜下观察靶向EGFR的重组蛋白光敏剂光照后杀灭宫颈癌Hela细胞，图6是靶向EGFR的重组蛋白光敏剂不同条件下杀灭Hela细胞效果和量效关系（靶向EGFR的重组蛋白光敏剂对Hela细胞的增殖抑制）。 具体实施方式本专利技术是靶向向EGFR的重组蛋白光敏剂及其制备方法，靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，该光敏剂是通过将6×His蛋白纯化标签、EGFR干扰序列、linker蛋白、集孢藻PCC7120藻蓝蛋白α进行融合，构建融合蛋白光敏剂，经过发酵和纯化后，去除6×His标签，获得可以靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，经630nm光照后可以杀灭肿瘤细胞。 以上所述的靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，融合蛋白EGFR干扰序列选自SEQ ID NO.1，藻蓝蛋白α亚基序列选自SEQ ID NO.2，并和linker和6×His蛋白纯化标签序列融合而成。 根据以上所述的靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，融合蛋白具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列。 根据以上所述的靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，编码融合蛋白的基因具有SEQ ID NO.4的核苷酸序列。 靶向EGFR的重组蛋白光敏剂的制备方法，其步骤为： （1）设计引物EGFRi1和EGFRi2，即序列3和序列4，linker1和linker2，即序列5和序列6，以及PCα1和PCα2，即序列7和序列8；（2）从培养的集孢藻PCC7120中提取总DNA，利用PCR的方法克隆藻蓝蛋白α亚基基因PCα；（3）以EGFRi1和EGFRi2为引物进行重叠延伸PCR扩增，得到EGFRi－linker1核苷酸序列；（4）以linker1和linker2为引物进行重叠延伸PCR扩增，得到linker2-PCα1核苷酸序列；（5）以EGFRi-linker1和linker2-PCα1为模版，以EGFRi1和linker2为引物进行PCR扩增，得到EGFRi-linker-PCα1核苷酸序列；（6）以EGFRi-linker-PCα1和PCα为模版，以EGFRi1和PCα2为引物得到完整的融合蛋白基因序列，融合序列全长600BP；（7）将融合基因序列克隆入表达载体pCDF -cpcE-cpcF, ho1-pcyA 载体，构建pCDF-pcα-cpcE-cpcF，ho1-pcyA转化DH5α；（8）培养重组菌种8h，诱导表达12h，超声破碎菌体，用镍亲和色谱柱纯化蛋白，用TAGZyme去除6×His标签，得到纯化的重组蛋白光敏剂。实施例1： （1）重组菌种的构建：设计引物EGFRi1和EGFRi2（序列3和序列4），linker1和linker2（序列5和序列6），以及PCα1和PCα2（序列7和序列8）；从培养的集孢藻PCC7120中提取总DNA，利用PCR的方法克隆藻蓝蛋白α亚基基因PCα；以EGFRi1和EGFRi2为引物进行重叠延伸PCR扩增，得到EGFRi－linker1核苷酸序列；以linker1和linker2为本文档来自技高网...
【技术保护点】
靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，该光敏剂是通过将6×His蛋白纯化标签、EGFR干扰序列、linker蛋白、集孢藻PCC7120藻蓝蛋白α进行融合，构建融合蛋白光敏剂，经过发酵和纯化后，去除6×His标签，获得可以靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，经630nm光照后可以杀灭肿瘤细胞。
【技术特征摘要】
1.靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，该光敏剂是通过将6×His蛋白纯化标签、EGFR干扰序列、linker蛋白、集孢藻PCC7120藻蓝蛋白α进行融合，构建融合蛋白光敏剂，经过发酵和纯化后，去除6×His标签，获得可以靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，经630nm光照后可以杀灭肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，其特征在于融合蛋白EGFR干扰序列选自SEQ ID NO.1，藻蓝蛋白α亚基序列选自SEQ ID NO.2，并和linker和6×His蛋白纯化标签序列融合而成。
3.根据权利要求1所述的靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，其特征在于融合蛋白具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的靶向EGFR的重组蛋白光敏剂，其特征在于编码融合蛋白的基因具有SEQ ID NO.4的核苷酸序列。
5.靶向EGFR的重组蛋白光敏剂的制备方法，其步骤为：
（1）设计引物EGFRi1和EGFRi2，即序列3和序列4，linker1和linker2，即序列5和序列6，以及PCα1和PCα2，即序列7和序列8；
（2）从培养的集孢藻PCC7120中提取总DNA，利用PCR的方法克隆藻蓝蛋白α亚基基因PCα；
（3）以EGFRi1和EGFRi2为引物进行重叠延伸P...
【专利技术属性】
技术研发人员：张伟杰，王永刚，马建忠，冷非凡，蒲秀瑛，陈卓，张庭瑞，
申请(专利权)人：兰州理工大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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