突变型内切葡聚糖酶制造技术

提供由来源于木质素的芳香族化合物造成的活性抑制降低了的内切葡聚糖酶。野生型的来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的氨基酸序列中的位置273的色氨酸被替换为除了芳香族氨基酸以外的氨基酸的内切葡聚糖酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的突变型内切葡聚糖酶。
技术介绍
近年来，受到化石资源枯竭、地球温暖化这样的问题影响，强烈要求从可再生且碳平衡的资源纤维素制造乙醇、化成品原料。纤维素在草本系植物、木本系植物中大量含有，将这些植物总称为纤维素系生物质。纤维素系生物质的细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素构成。纤维素是由葡萄糖分子β-1,4键合而成的直链状多糖，半纤维素是木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖等多糖，木质素是具有复杂的结构的芳香族系高分子化合物，在细胞壁中与纤维素、半纤维素互相缠绕而形成三维网眼结构。为了从纤维素系生物质制造乙醇、化成品原料，需要分解至微生物能发酵的单糖的被称为“糖化”的工序。代表性的糖化法，可列举酸处理法、酶处理法，但由于酸处理法产生大量的废液、环境负荷高，因而，现在利用纤维素酶在温和条件下进行反应的酶处理法成为开发的主流。纤维素酶是纤维素水解酶的总称，由于底物特异性不同而被分类为纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶3种。认为通过它们协同作用而纤维素的水解进行。在使用纤维素酶将纤维素系生物质进行糖化时，由于底物抑制、生成物抑制、非特异性吸附等各种原因而活性被抑制。此外，已知由于来源于木质素的芳香族化合物而内切葡聚糖酶等纤维素酶的活性被抑制(非专利文献1～3)。然而其抑制机理尚不明。由嗜热菌或超嗜热菌产生的酶由于稳定性高、即使在高温条件也能长时间保持活性，因而被研究了作为产业用酶的应用。到目前为止关于由纤维素分解性嗜热菌或超嗜热菌产生的纤维素酶也进行了研究，明确了它们所具有的纤维素酶基因大多数编码内切葡聚糖酶。现有技术文献非专利文献非专利文献1：Vohra,R.M等、Biotechnol.Bioeng.,22,1497-1500(1980)非专利文献2：Paul,S.S等、Lett.Appl.Microbiol.,36,377-381(2003)非专利文献3：Ximenes,E等、Enzym Microb Tech.,46,170-176(2010)
技术实现思路
专利技术要解决的课题到目前为止，已知使用纤维素酶将纤维素系生物质进行糖化时，由于来源于木质素的芳香族化合物而内切葡聚糖酶等纤维素酶的活性被抑制。本专利技术提供由来源于木质素的芳香族化合物造成的活性抑制大幅降低了的突变型内切葡聚糖酶。另外，本专利技术提供在将含有纤维素、特别是木质素的纤维素系生物质进行水解来制造糖液的方法中使用分解效率高的酶组合物的制造方法。用于解决课题的方法本专利技术者们为了实现上述的目的，在来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的特定位置导入氨基酸突变，成功地获得了具有其功能改良了的性质的突变型内切葡聚糖酶。详细来说，专利技术者们着眼于作为野生型的亲内切葡聚糖酶的三维结构，通过蛋白质晶体结构分析，来特定参与亲内切葡聚糖酶与来源于木质素的芳香族化合物的复合体结构形成的氨基酸，通过对该氨基酸选择性地施加突变，从而成功地获得了由来源于木质素的芳香族化合物造成的活性抑制大幅降低了的内切葡聚糖酶。即，本专利技术包含以下构成。突变型内切葡聚糖酶，包含：在来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸残基被替换成从芳香族氨基酸以外选出的氨基酸的氨基酸序列。根据[1]的突变型内切葡聚糖酶，来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的氨基酸序列包含以下(a)、(b)或(c)的任一氨基酸序列：(a)序列号1、7、13、19、25、31或37所示的、编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的氨基酸序列；(b)在序列号1、7、13、19、25、31或37所示的氨基酸序列中缺失、替换、或添加了1个～数个氨基酸、且编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的氨基酸序列；(c)与序列号1、7、13、19、25、31或37所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性、且编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的氨基酸序列。根据[1]或[2]的突变型内切葡聚糖酶，与序列号1的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸残基被替换成丙氨酸。根据[1]～[3]的任一突变型内切葡聚糖酶，包含序列号2、8、14、20、26、32或38所示的氨基酸序列。编码[1]～[4]的任一突变型内切葡聚糖酶的DNA。根据[5]的DNA，包含序列号4、10、16、22、28、34或40所示的碱基序列。表达载体，包含[5]或[6]的DNA。转化细胞，是通过使用了[7]的表达载体的转化而制作的。突变型内切葡聚糖酶的制造方法，包括：(1)培养[8]的转化细胞的工序；和(2)对由该转化细胞所生产的突变型内切葡聚糖酶进行纯化的工序。生物质分解用组合物，包含[1]～[4]的任一突变型内切葡聚糖酶和/或[8]的转化细胞的处理物。由来源于纤维素的生物质制造糖液的方法，包括在含纤维素的生物质悬浮液中添加[10]的生物质分解用组合物而进行水解的步骤。根据[11]的方法，进一步包括添加来源于丝状菌的纤维素酶的步骤。本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2011-193279号的说明书和/或附图所记载的内容。专利技术的效果本专利技术的突变型内切葡聚糖酶，由来源于木质素的芳香族化合物所造成的活性抑制大幅降低。因此，在将含有纤维素、特别是木质素的纤维素系生物质进行水解来制造糖液时，能够高效率地分解木质纤维素，因此通过作为酶组合物使用，可以效率良好地制造糖液。附图说明图1-1是显示实施例1中的序列号1的来源于掘越氏热球菌的内切葡聚糖酶(EGPh)与来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的比对的图。将序列号1中的位置273的色氨酸用下划线显示。图1-2是图1-1的继续。图1-3是图1-2的继续。图1-4是图1-3的继续。具体实施方式以下详细说明本专利技术。本专利技术涉及由来源于木质素的芳香族化合物所造成的活性抑制与亲内切葡聚糖酶相比大幅降低的突变型内切葡聚糖酶。在本说明书中，来源于木质素的芳香族化合物只要是作为木质素的前体物质一般称为单木质醇(monolignol)的芳香族化合物、及其生物合成途径中存在的芳香族化合物、和分解纤维素系生物质而得的芳香族化合物，就不特别限定，也可以是一种以上的混合物。作为称为单木质醇(monolignol)的芳香族化合物、及其生物合成途径中存在的芳香族化合物，可列举例如，松柏醇、芥子醇、对本文档来自技高网...

【技术保护点】
突变型内切葡聚糖酶，包含：在来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸残基被替换成从芳香族氨基酸以外选出的氨基酸的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.05 JP 2011-1932791.突变型内切葡聚糖酶，包含：在来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的氨
基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸
残基被替换成从芳香族氨基酸以外选出的氨基酸的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的突变型内切葡聚糖酶，来源于嗜热菌的内切
葡聚糖酶的氨基酸序列包含以下(a)、(b)或(c)的任一氨基酸序列：
(a)序列号1、7、13、19、25、31或37所示的、编码具有内切葡聚糖
酶活性的蛋白质的氨基酸序列；
(b)在序列号1、7、13、19、25、31或37所示的氨基酸序列中缺失、
替换、或添加了1个～数个氨基酸、且编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白
质的氨基酸序列；
(c)与序列号1、7、13、19、25、31或37所示的氨基酸序列具有90
％以上的序列同一性、且编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的氨基酸序
列。
3.根据权利要求1或2所述的突变型内切葡聚糖酶，与序列号1的氨
基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸残基被...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗原宏征，冢田刚士，山田胜成，三岛由美子，前野友香，石川一彦，
申请(专利权)人：东丽株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP