免疫增强的人乳头瘤病毒感染及相关疾病的治疗性疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种免疫增强的人乳头瘤病毒感染及相关疾病的治疗性疫苗，其包括基于重组腺病毒的基因载体。为了获得针对HPV的协同免疫增强效果，该类治疗性疫苗含有三个关键元素：1）有效表达HPV病毒抗原，包含HPV16型和18型的E6、E7多价融合蛋白；2）有效表达与前述抗原蛋白融合的免疫佐剂蛋白，包含结核杆菌的热休克蛋白（HSP）；3）同时表达免疫刺激因子，包含粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF。该疫苗通过对小鼠体内含HPV抗原的肿瘤治疗实验表明，能有效增强免疫反应并清除肿瘤。本发明专利技术展示了HSP融合蛋白与GM-CSF对HPV抗原的协同免疫刺激作用，为宫颈癌及其它HPV感染所致疾病的治疗性疫苗提供了新的方法。

【技术实现步骤摘要】
免疫增强的人乳头瘤病毒感染及相关疾病的治疗性疫苗
本专利技术属于疫苗领域，具体涉及一种人乳头瘤病毒持续性感染及其所诱发的宫颈癌及其它病变的治疗性疫苗，更具体的，涉及含有免疫增强剂的人乳头瘤病毒治疗性疫苗。
技术介绍
世界范围内，宫颈癌是女性第二大高发癌症，每年约274,000患者死于该病。所有的宫颈癌均可检出HPV感染。此外，肛门、阴道、阴茎癌及某些口腔癌及喉癌也与HPV感染有关。虽然目前已经有两种预防性疫苗投放市场，但其对已存在的HPV感染并无任何治疗效果，更无法阻断病变恶性化进程。并且，据估算现已被HPV感染的病人基数很大，所以通过大规模接种预防性疫苗达到减少宫颈癌发病率，至少需要20年后才能明显见效。由于已有大量人群感染病毒甚至已发生宫颈癌或癌前病变，因此以清除已被感染的细胞和癌细胞为目的的治疗性疫苗的研发非常迫切。人乳头瘤病毒E6和E7蛋白是HPV病毒携带的二个致癌基因所编码的癌蛋白，属非自体的外源蛋白抗原，从癌前病变到宫颈癌发生它们都持续稳定表达，因此是非常理想的免疫治疗靶点。大量临床研究都试图以这两种癌蛋白为靶点，包括重组病毒、多肽、蛋白和DNA疫苗。这些治疗性疫苗都显示了很好的安全性，在某些病人身上也出现了病灶的消退和生存期延长。此外，研究表明疫苗免疫所诱发的T细胞免疫强度与治疗治疗效果有关。尽管某些临床研究已经出现希望，但如果想彻底治愈持续感染和清除癌症，还需要新的策略来诱导足以强大的抗肿瘤特异性抗原的T细胞免疫反应。热休克蛋白（HSP）可以有效地调节细胞功能，增强免疫反应。首先，它可以作为“分子伴侣”起作用，帮助蛋白运输定位和辅助蛋白折叠。其次，它可以活化专职抗原递呈细胞（APC），而HSP70可以与巨噬细胞上的受体结合，从而有效激活其免疫反应。SGN-00101是一种融合有HPV16型E7蛋白和结核杆菌的HSP65的融合蛋白，其已经表现出了良好的安全性，并且对抑制宫颈上皮细胞的高度不典型增生有一定效果。粒-单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）是已被广泛研究并被认为是最有效的免疫治疗因子之一。它可以介导自然杀伤细胞和通过抗原提呈细胞来活化肿瘤特异的CD8+杀伤性T淋巴细胞，从而起到抗肿瘤作用。诸多动物和临床试验已经证实其可以长期有效激发肿瘤抑制免疫反应。例如，Sipuleucel-T作为一种免疫治疗药物，就是利用了GM-CSF活化抗原递呈细胞的特点，现在已经被美国食品药品安全管理局批准上市。Jennerex等人的最新临床研究也表明表达有GM-CSF的融癌痘苗病毒可以减小多种癌症病灶。但这些增强免疫的方法其疗效都不理想，要么缺乏肿瘤抗原特异性，要么免疫刺激强度欠佳。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种免疫增强的人乳头瘤病毒感染及相关疾病的治疗性疫苗。首先，本专利技术提供一种人乳头瘤病毒及免疫增强分子五基因型融合抗原，其含有人乳头瘤病毒16型的E6、E7蛋白和人乳头瘤病毒18型的E6、E7蛋白及免疫增强分子佐剂蛋白。本专利技术采用多价抗原线性排列的方式，对融合蛋白的T细胞表位未有影响。在治疗疫苗中起中心作用的是T细胞免疫反应，而T细胞抗原决定簇在递呈过程中被降解成线性短肽，而识别位点一般仅有大约8个氨基酸，所以各种抗原排列顺序也对免疫激发没有实质影响。本专利技术我们融合了HPV16及18型的4抗原蛋白与热休克蛋白分子，融合更多HPV抗原有更大的优势：可以提供更多的潜在抗原决定簇，增强抗原的递呈及增加免疫反应，对更多不同基因型的HPV感染起作用。从而有效的提高潜在的疫苗免疫的受益人群；并且更大的蛋白更容易被降解提成，从而激发更强的免疫反应。在本专利技术一个实施方案中，所述的融合抗原具有下述一或多个突变位点，其中，所述的人乳头瘤病毒16型E6蛋白的突变位点为：121位的谷氨酸突变为甘氨酸；122位的赖氨酸突变为甘氨酸；所述的人乳头瘤病毒16型E7蛋白的突变位点为：24位的半胱氨酸突变为甘氨酸；26位的谷氨酸突变为甘氨酸；所述的人乳头瘤病毒18型E6蛋白的突变位点为：116位的谷氨酸突变为甘氨酸；117位的赖氨酸突变为甘氨酸；所述的人乳头瘤病毒18型E7蛋白的突变位点为：27位的半胱氨酸突变为甘氨酸；29位的谷氨酸突变为甘氨酸。本专利技术对HPVE6蛋白中与细胞p53蛋白的结合区域进行了氨基酸的点突变，同时也对E7蛋白中与细胞pRb蛋白的结合区域进行了氨基酸的点突变。突变后的蛋白将不再与上述两种蛋白特异结合，从而消除HPVE6及E7蛋白的潜在转化正常细胞的风险。需要说明的是，本专利技术仅在几处关键位点进行了点突变，对融合蛋白的抗原性未有影响。其中，所述的免疫增强分子佐剂蛋白为原核生物或哺乳动物热休克蛋白，优选为结核杆菌的热休克蛋白。在本专利技术一个具体的实施方案中，人乳头瘤病毒及免疫增强分子五基因型融合抗原的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。进一步地，本专利技术提供一种表达所述的含有所述融合抗原的重组基因表达载体。在本专利技术一个实施方案中，所述的载体优选还可以同时携带免疫刺激因子的表达盒。优选的，所述的免疫刺激因子为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF、白介素、干扰素或细胞趋化因子，优选为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF。在本专利技术一个具体的实施方案中，所述的表达载体携带核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的DNA片段。其中，所述载体可为重组腺病毒载体（adenoviralvector），亦可为重组腺相关病毒载体（adeno-associatedviralvector）、重组逆转录病毒载体（retroviralvector）、重组慢病毒载体（lentiviralvector）、重组疱疹病毒载体（Herpesviralvector）、重组痘苗病毒载体（Vacciniavector）或者重组仙台病毒载体（Sandaiviralvector）；也可为非病毒载体，所述非病毒载体选自裸DNA载体、纳米颗粒，多聚物或脂质体。进一步地，本专利技术还提供一种治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的药物制剂，其包含治疗有效量的所述的融合抗原，或包含治疗有效量的所述的重组基因表达载体。在一个优选的实施方案中，所述的药物制剂包含治疗有效量的所述的融合抗原以及免疫刺激因子。其中，所述的免疫刺激因子为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF、白介素、干扰素或细胞趋化因子，优选为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF。在本专利技术一个具体的实施方案中，所述药物制剂所表达的抗原为所述人乳头瘤病毒16型18型的E6、E7多基因型融合抗原，所表达的免疫增强分子佐剂为结核杆菌的热休克蛋白并与前述多价融合蛋白再融合，所表达的免疫刺激因子为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF。在本专利技术另一个具体的实施方案中，所述的药物制剂还可以含有药学可接受的载体、赋形剂、辅料等。在本专利技术一个具体的实施方案中，该药物制剂可作为疫苗直接一次性注射或一次以上的加强免疫注射到病人体内，以达到刺激和增强免疫的效果。也作为一种抗原，间接用于处理和孵育体外病人自体细胞或供体细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、脐带血细胞等。再分一次性或多次性注射到病人体内，以达到刺激和增强免疫的效果。进一步地，本专利技术提供一种重组腺病毒，其携带所述的重组基因表达载体。在本专利技术的一个具体实施方案中，所述的重组腺病毒表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人乳头瘤病毒及免疫增强分子五基因型融合抗原，其由人乳头瘤病毒16型的E6、E7蛋白和人乳头瘤病毒18型的E6、E7蛋白及结核杆菌的热休克蛋白组成,其特征在于，其具有下述突变位点，其中，所述的人乳头瘤病毒16型E6蛋白的突变位点为：121位的谷氨酸突变为甘氨酸；122位的赖氨酸突变为甘氨酸；所述的人乳头瘤病毒16型E7蛋白的突变位点为：24位的半胱氨酸突变为甘氨酸；26位的谷氨酸突变为甘氨酸；所述的人乳头瘤病毒18型E6蛋白的突变位点为：116位的谷氨酸突变为甘氨酸；117位的赖氨酸突变为甘氨酸；所述的人乳头瘤病毒18型E7蛋白的突变位点为：27位的半胱氨酸突变为甘氨酸；29位的谷氨酸突变为甘氨酸，其中所述人乳头瘤病毒16型的E6、E7蛋白和人乳头瘤病毒18型的E6、E7蛋白的融合蛋白氨基酸序列由SEQIDNO.1所示。2.一种表达权利要求1所述融合抗原的重组基因表达载体。3.如权利要求2所述的重组基因表达载体，其特征在于，其携带有表达权利要求1所述的融合抗原的表达盒，以及表达免疫刺激因子的表达盒。4.如权利要求3所述的重组基因表达载体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：边涛，刘娟，肖啸，
申请(专利权)人：南京勉益生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：