抗CA199单克隆抗体产生的杂交瘤及化学发光免疫分析试剂盒的制备制备，属于免疫分析医学领域。本发明专利技术提供了一种特异性识别CA199的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，以及使用该单克隆抗体检测CA199的高灵敏度的方法；还提供了CA199化学发光免疫分析检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括：CA199检测反应板、酶结合物、发光底物、标准品、质控品、浓缩洗涤液。本发明专利技术用细胞融合和杂交瘤技术研发出灵敏度高、特异性好的抗体；同时用自主研发抗体将免疫学与化学发光技术相结合，研制出检测范围宽、灵敏度高、操作方便、生产成本低的试剂盒。临床检测人血清中CA199的含量，对胰腺癌的早期筛查提供重要参考依据。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】抗CA199单克隆抗体产生的杂交瘤及化学发光免疫分析试剂盒的制备制备，属于免疫分析医学领域。本专利技术提供了一种特异性识别CA199的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，以及使用该单克隆抗体检测CA199的高灵敏度的方法；还提供了CA199化学发光免疫分析检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括：CA199检测反应板、酶结合物、发光底物、标准品、质控品、浓缩洗涤液。本专利技术用细胞融合和杂交瘤技术研发出灵敏度高、特异性好的抗体；同时用自主研发抗体将免疫学与化学发光技术相结合，研制出检测范围宽、灵敏度高、操作方便、生产成本低的试剂盒。临床检测人血清中CA199的含量，对胰腺癌的早期筛查提供重要参考依据。【专利说明】抗CA199单克隆抗体产生的杂交瘤及化学发光免疫分析试剂盒的制备【
】本专利技术涉及CA199单克隆抗体产生的杂交瘤及检测血清中CA199含量的试剂盒，可广泛应用在医学和及生物化学
。【背景知识】CA 199是对人结肠癌细胞株SWl 116免疫的鼠脾细胞与大鼠骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体1116NS1929所识别的一种糖抗原。CA199是以单涎酸神经节甙脂的形式出现在组织中，以类粘蛋白的形式出现在胰腺癌患者血清中。CA199的检测对肿瘤，特别是消化道肿瘤有较大的诊断作用，对胰腺癌的诊断敏感性可达70%-95%，特异性为72%-90%。虽然CA199对胰腺癌的敏感性很高，但是在急慢性胰腺炎、胆道阻塞、胆囊炎、肝硬化和肝炎等疾病中，CA199同样会出现不同程度升高的现象。胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，由于早期缺乏典型的临床表现，临床上90%以上的患者确诊时已经属于中晚期，失去最佳治疗时机。在世界普通癌症中，男性患胰腺癌居世界第四位，女性居第五位，而且预后效果差。目前研究热点在于探求特异性的早期诊断肿瘤标志物，实现对胰腺癌的早期诊断，提高胰腺癌患者的生存率，在早期、更加准确的确诊胰腺癌依然是治疗该疾病的关键。目前在临床实验室检测PSA的方法主要是放射免疫分析(RIA)、免疫比浊法和酶联免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必须用放射性元素标记，检测设备复杂昂贵，其放射性元素的半衰期短，不能长期保存，检测结果不稳定，同时存在放射性污染也给实验操作人员带来了伤害；酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。本专利技术采用的化学发光免疫分析方法(CLIA)灵敏度比较高，可以达到10-18mol/L，快速，发光信号在几秒钟就能产生，操作方便，且不使用有害的试剂，与国内的同类试剂相比，具有灵敏度很高，操作简便，更重要的是其需要的血清量少、检测范围广、发光液持续时间长的优点，更能满足临床的需要，本专利技术的试 剂与国外同类试剂相比，达到国外同类产品水平。【
技术实现思路
】本专利技术的目的在于提供一种抗CA199单克隆抗体产生的杂交瘤以及建立一种简单且具高灵敏度的检测CA199的方法，并将该方法应用胰腺癌的早期筛查。以解决现有的单克隆抗体检测CA199的灵敏度不够或价格昂贵，不适合临床大规模的应用的缺点。本专利技术的另一目的在于提供一种CA199化学发光免疫分析测定试剂盒以及该试剂盒的制备方法。利用该试剂盒分析检测灵敏度高、特异性强。本专利技术获得了能够产生特异性识别CA199的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株1-1与杂交瘤细胞株2-1，此2株细胞株分别在2014年I月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC C201405与CCTCCC201406。此外，经过鉴定，两株单克隆抗体分别识别CA199的两个不同表位，通过1_1与2-1的结合建立了双抗体夹心酶联免疫反应方法，其是一种高灵敏度及高通量的检测系统。因此，本专利技术提供了下面所述的I至7的内容:1.抗CA199的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCC C201405和CCTCC C201406。2.抗CA199的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCC C201405和CCTCC C201406的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为1-1和2-1。3.如权利要求2所述的抗CA199单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测CA199，夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCC C201405杂交瘤分泌的抗体1-1和保藏号为CCTCC C201406杂交瘤分泌的抗体2_1，其步骤包括:(I)以所述的两两配对的单克隆抗体1-1包被；(2)加入待测样品孵育；(3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体2-1作为二抗，加入反应体系;(4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值；(5)结果表明检测的灵敏度很高。4.一种检测血清中CA199含量的试剂盒，包括:包被有抗CA199单克隆抗体1_1的不透明聚苯乙烯板；CA199抗原系列标准品；酶标记的CA199单克隆抗体2_1 ;上述酶所作用的化学发光底物A液和B液以及洗涤液。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被单克隆抗体1-1，包被 液是磷酸盐缓冲液；另一株CA199单克隆抗体2-1和辣根过氧化酶偶联形成酶标记抗体，采用的是改良的过碘酸钠法进行标记；CA199抗原系列标准品以小牛血清为基质，加入CA 199抗原纯品配置而成；发光底物A、B为HRP-Luminol发光体系O6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:标记抗体所用的标记酶是辣根过氧化酶，用的是高碘酸钠氧化法，所得酶标记抗体最佳的工作浓度是1:2000 ;包被有抗CA199抗体的不透明聚苯乙烯板采用的是直接物理吸附法包被；发光液A液用硼砂7.99g，硼酸3.46g，鲁米诺0.28g，对碘苯酚0.07g,加工艺用水定容至700mL，避光保存；发光底物B液由下列成分组成:硼砂7.99g,硼酸3.46g,过氧化脲0.07g加工艺用水定容至700mL。7.如权利要求4-6所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤: (I)标准品的配制和浓度的校正将CA199抗原纯品，加入标准品稀释液，配制一高浓度标准品浓液，采用逐低稀释的方法稀释到各浓度，配制成O、10、50、100、400、1000U/mL的系列标准品，标准品用国家标准品校正。(2)包被采用0.5mol/L, pH值为9.5的磷酸盐缓冲液与CA199单抗混合成抗体浓度是2 μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上,4°C孵育过夜；(3)洗板用PBS-T洗液洗板孔2次；(4)封闭封闭液包含NaC18.00g,KC10.20g,Na2HPO4.12Η202.90g,KH2PO40.20g，蔗糖 20.0Og,proclin300 1.00mL，BSA20.00g，封闭液的PH值为7.3-7.5，150 μ L/孔封闭，湿盒放置孵育3h ；(5)干燥去除封闭液，过夜干燥。(6)组装为成品将聚苯乙烯板子放入铝箔袋中并放入干燥剂，密封保存。上述的抗CA199的单克隆抗体，是由下列的方法所制备，步骤包括:(I)用蛋白量为15KU的CA199抗原与弗氏完全佐剂混合；经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再1本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗CA199的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCC C201405和CCTCC C201406。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蓝兴国，李玉花，李晓屿，张天沛，曹领改，
申请(专利权)人：东北林业大学，东北林业大学大庆生物技术研究院，李玉花，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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